Sistemik skleroz; bağışıklık sistemi bozukluğu, küçük damar hasarı, inflamasyon ve aşırı bağ dokusu birikiminin birlikte görüldüğü, deri ile akciğer başta olmak üzere birden fazla organı etkileyebilen ciddi bir hastalıktır. Fibrozis olarak adlandırılan bu süreçte kollajen ve diğer hücre dışı matriks bileşenleri dokuda gereğinden fazla birikir. Özellikle interstisyel akciğer hastalığı ve pulmoner damar tutulumu, sistemik skleroza bağlı ölüm yükünün başlıca nedenleri arasındadır.

Bu preklinik araştırma, hücresel enerji metabolizmasının merkezindeki moleküllerden biri olan alfa-ketoglutaratın, kısaca α-KG’nin, sistemik sklerozla ilişkili fibrozis üzerindeki etkisini incelemiştir. α-KG, trikarboksilik asit döngüsünün bir ara ürünüdür; enerji metabolizmasının yanında epigenetik düzenleme, hipoksi yanıtı, redoks dengesi ve kollajen biyolojisiyle ilişkili enzimlerde yardımcı molekül olarak görev yapar.

Araştırmacılar başlangıçta beklenmedik bir sonuçla karşılaşmıştır: α-KG düzeyi hem bleomisinle fibrozis oluşturulan fare akciğerlerinde hem de TGF-β ile aktive edilen insan fibroblastlarında normalden daha yüksek bulunmuştur. Bu artış ilk bakışta α-KG’nin fibrozisin bir parçası olabileceğini düşündürebilir. Ancak dışarıdan ilave α-KG verilmesi, TGF-β’nin fibroblastlarda oluşturduğu kollajen artışını azaltmıştır. Yazarlar bu nedenle endojen α-KG yükselişini, fibrozisi durdurmaya çalışan fakat tek başına yetersiz kalan telafi edici bir metabolik yanıt olarak yorumlamıştır. Bu yorum deneysel sonuçlarla uyumludur ancak doğrudan kanıtlanmış bir fizyolojik mekanizma değildir.

Çalışmada toplam 96 erkek C57BL/6 fare kullanılmıştır. Hayvanlar deri ve akciğer fibrozisi deneylerine ayrılmış; her deney kolunda kontrol, bleomisin ve bleomisinle birlikte α-KG verilen gruplar oluşturulmuştur. Farelere α-KG ağızdan mideye uygulama yoluyla günlük 50 mg/kg dozunda verilmiştir. Akciğer fibrozisi intratrakeal 3 mg/kg bleomisinle, deri fibrozisi ise günlük deri altı bleomisin enjeksiyonlarıyla oluşturulmuştur.

Akciğer modelinde α-KG; kilo kaybını hafifletmiş, inflamatuvar hücre girişini azaltmış, TNF-α, IL-1β ve IL-6 düzeylerini düşürmüş ve NF-κB ile p38 MAPK inflamasyon yollarının aktivasyonunu baskılamıştır. Fibrozis döneminde Masson boyamasıyla gösterilen kollajen birikimi azalmış; COL1A1, α-SMA, Tgfb1, Col1a1 ve Fn1 gibi fibrozis göstergelerinde gerileme saptanmıştır.

Bleomisin grubunda 21 günlük gözlem sırasında farelerin %37,5’i ölürken kontrol ve bleomisin+α-KG gruplarında ölüm gözlenmemiştir. Bu sonuç deneysel model içinde anlamlı bir sağkalım farkına işaret etmektedir. Bununla birlikte her gruptaki ilgili hayvan sayısı küçüktür ve sonuç insanlarda sağkalım yararı anlamına gelmez.

Çalışmanın en dikkat çekici bulgusu, α-KG’nin başlıca hücresel hedefinin yalnızca fibroblastlar olmayabileceğidir. Altı akciğer örneğinden elde edilen 29.434 hücrenin tek hücreli RNA dizilemesi, α-KG sonrasında en fazla gen ifade değişiminin endotel hücrelerinde meydana geldiğini göstermiştir. Özellikle arteriyel endotel hücreleri belirgin bir transkriptomik yanıt vermiştir.

Endotel hücreleri damarların iç yüzeyini kaplar ve damar geçirgenliği, kan akımı, yeni damar oluşumu, doku oksijenlenmesi ve bağışıklık hücrelerinin dokuya geçişi üzerinde belirleyici rol oynar. Sistemik sklerozda kılcal damar kaybı, bozulmuş anjiyogenez ve endotel bariyer hasarı fibrozis belirginleşmeden önce başlayabilir. Çalışmanın bulguları, α-KG’nin bu damar hasarı-fibrozis bağlantısına müdahale edebileceğini düşündürmektedir.

İnsan göbek kordonu ven endotel hücrelerinde yürütülen deneylerde bleomisin; hücre canlılığını, göçünü ve tüp oluşturma kapasitesini azaltmıştır. Dimetil-α-KG uygulanması bu bozuklukların önemli bölümünü geri çevirmiştir. Ayrıca damar homeostazıyla ilişkili eNOS ile endotel bariyerini oluşturan ZO-1 ve Occludin proteinlerinin düzeyleri yeniden yükselmiştir.

Tek hücreli yolak analizlerinde bleomisin, arteriyel endotel hücrelerindeki yağ asidi omega oksidasyonu ve sitokrom P450 aracılı oksidasyon yollarını baskılamış; α-KG bu metabolik yolları kontrol grubuna yakın düzeye taşımıştır. Elektron mikroskobunda bleomisinin oluşturduğu mitokondri krista parçalanması ve matriks şişmesinin α-KG ile hafiflediği, mitokondri yoğunluğunun arttığı görülmüştür. Mitokondri biyogenezini düzenleyen NRF1 proteini de yükselmiştir.

Deri fibrozisi modelinde de benzer bir etki gözlenmiştir. α-KG; deri kalınlaşmasını, makrofaj girişini, serum inflamatuvar sitokinlerini, kollajen birikimini, COL1A1 ve p-Smad2 boyanmasını azaltmıştır. Böylece çalışmada α-KG’nin yalnızca akciğere özgü değil, iki temel sistemik skleroz hedef organında etkili olabilecek bir preklinik aday olduğu ileri sürülmüştür.

Ancak araştırma insanlarda yapılmamıştır. Bleomisin modeli, insan sistemik sklerozunun kronik otoimmün yapısını ve karmaşık damar hastalığını bütünüyle taklit etmez. Çalışmada yalnızca genç erkek fareler kullanılmış, hasta kaynaklı dokularda doğrulama yapılmamış, uzun dönem güvenlik ve farmakokinetik değerlendirilmemiştir. Hücre çalışmalarında kullanılan dimetil-α-KG ile farelere verilen α-KG aynı farmakolojik form değildir. Bu nedenle sonuçlar, α-KG takviyelerinin sistemik skleroz hastaları tarafından kullanılmasını destekleyen klinik kanıt olarak yorumlanamaz.

Sistemik sklerozda temel biyolojik problem nedir?

Sistemik skleroz, İngilizce adıyla systemic sclerosis veya SSc, bağışıklık sisteminin yanlış düzenlenmesi, damar iç yüzeyindeki hasar ve fibroblastların aşırı etkinleşmesiyle karakterize çok sistemli bir hastalıktır. Çalışmada hastalığın tahmini prevalansının bir milyon kişide yaklaşık 100-300 vaka arasında olduğu belirtilmektedir.

Hastalığın üç temel biyolojik bileşeni birbirini besleyebilir:

• Vaskülopati: Küçük damarların ve endotel tabakasının hasarlanması, kılcal damarların azalması ve yeni damar oluşturma kapasitesinin bozulması.
• İmmün aktivasyon: Sitokinler, makrofajlar ve diğer bağışıklık bileşenleri üzerinden devam eden inflamatuvar yanıt.
• Fibrozis: Fibroblastların miyofibroblast benzeri hücrelere dönüşmesi ve kollajen başta olmak üzere hücre dışı matriks bileşenlerini aşırı üretmesi.

Bu süreçler özellikle deri ve akciğerde sertleşme, doku mimarisinin bozulması ve işlev kaybı oluşturabilir. Akciğerde kollajen birikimi gaz alışverişinin gerçekleştiği ince dokuyu kalınlaştırabilir. Damar hasarı ise doku oksijenlenmesini azaltarak fibroblast aktivasyonunu daha da destekleyebilir.

Çalışmanın giriş bölümünde mevcut tedavilerin büyük ölçüde bağışıklık baskılama ve belirtilerin kontrolüne odaklandığı, yerleşmiş fibrozisi bütünüyle durdurma veya geri çevirme kapasitesinin sınırlı olduğu vurgulanmaktadır. Bu nedenle yalnızca bağışıklık sistemini değil, hücre metabolizmasını ve damar işlevini de hedefleyen yeni yaklaşımlar araştırılmaktadır.

Alfa-ketoglutarat nedir?

Alfa-ketoglutarat, hücrelerin enerji üretiminde kullandığı trikarboksilik asit döngüsünün, diğer adıyla TCA veya Krebs döngüsünün merkezi ara ürünlerinden biridir. TCA döngüsü, besinlerden gelen karbonun mitokondride işlenerek enerji üretimine ve biyosentetik süreçlere aktarılmasını sağlar.

α-KG yalnızca enerji metabolizmasında bir ara basamak değildir. Çalışmada aşağıdaki işlevlerle ilişkilendirilmiştir:

• Hipoksi yanıtını düzenleyen PHD/HIF enzim sistemi,
• DNA ve histon demetilasyonunda görev alan TET ve KDM enzimleri,
• Kollajen proteinlerindeki prolin kalıntılarının hidroksilasyonu,
• Mitokondriyal oksidatif metabolizma,
• Epigenetik düzenleme,
• İnflamatuvar sitokin üretimi ve redoks dengesi.

Bu çok yönlü konumu nedeniyle α-KG, bir hücrenin yalnızca ne kadar enerji ürettiğini değil; hangi genleri etkinleştirdiğini, hasara nasıl yanıt verdiğini ve hangi hücresel kimliğe yöneldiğini de etkileyebilir.

α-KG’nin fibrotik dokuda zaten yüksek olması neden paradoksaldır?

Hedefli metabolomik analizde fibrotik fare akciğerleriyle normal akciğerler arasında değişen metabolitler karşılaştırılmıştır. α-KG, fibrotik dokuda belirgin biçimde yüksek bulunmuştur. TGF-β ile aktive edilen insan fibroblastlarında da aynı yönde artış görülmüştür.

İki farklı deney sisteminde ortak ve anlamlı biçimde yükselen tek metabolitin α-KG olması, araştırmacıların bu moleküle odaklanmasına neden olmuştur.

Normalde bir molekül hastalıklı dokuda yükseliyorsa şu olasılıklardan biri düşünülebilir:

• Molekül hastalığı teşvik ediyor olabilir.
• Hastalığın oluşturduğu metabolik tıkanma nedeniyle birikiyor olabilir.
• Hücrenin hastalığı sınırlamak için geliştirdiği telafi edici bir yanıt olabilir.

Çalışmanın sonuçları üçüncü açıklamayı desteklemektedir. Çünkü dışarıdan daha fazla α-KG verildiğinde fibrozis ağırlaşmamış, tersine kollajen üretimi ve fibrotik doku değişiklikleri azalmıştır.

Bununla birlikte bu, yükselen endojen α-KG’nin kesin olarak koruyucu olduğu anlamına gelmez. Endojen artışın kaynağı, hangi hücrelerde gerçekleştiği, üretim ve tüketim hızları veya α-KG’nin hücre içindeki bölgesel dağılımı doğrudan ölçülmemiştir. “Yetersiz telafi yanıtı” çalışmanın veriye dayalı mekanistik yorumudur.

Fibroblast deneyinin ilk mesajı

Fibroblastlar TGF-β ile uyarıldığında COL1A1 olarak ölçülen tip I kollajen düzeyi yükselmiştir. Dimetil-α-KG eklenmesi bu yükselişi azaltmıştır.

TGF-β, fibrozisin temel sinyal moleküllerinden biridir. Hücre yüzeyindeki reseptörlerine bağlandığında Smad proteinlerini etkinleştirir ve çekirdekte kollajen, fibronektin ve diğer matriks bileşenlerinin üretimini artıran gen programlarını başlatır.

Çalışmanın mekanistik zinciri sadeleştirilmiş biçimde şöyle ifade edilebilir:

\[ TGF-\beta \rightarrow Smad2/3\ aktivasyonu \rightarrow Fibroblast\ aktivasyonu \rightarrow Kollajen\ ve\ matriks\ birikimi \]

α-KG uygulanması bu zincirin farklı basamaklarını baskılamış görünmektedir. Akciğer ve deri dokusunda p-Smad2, COL1A1, α-SMA ve fibrozisle ilişkili genlerde azalma bildirilmiştir.

Ancak bütün protein ölçümleri aynı derecede güçlü değildir. Akciğer Western blot analizinde COL1A1 ve bazı α-SMA karşılaştırmaları anlamlı değişim gösterirken p-Smad2 miktarındaki değişim, grafikte verilen bireysel P değerlerine göre anlamlılık sınırına ulaşmamıştır. Buna karşılık immünohistokimyasal p-Smad2 boyanması ve deri modelindeki sonuçlar daha belirgin bir baskılanma göstermiştir. Bu nedenle TGF-β/Smad baskılanması birden fazla veri türünün ortak yorumudur; her tekil ölçümde aynı güçte doğrulanmamıştır.

Fare deneyinin ayrıntılı tasarımı

Çalışmada 6-8 haftalık, yalnızca erkek C57BL/6 fareler kullanılmıştır. Fareler iki ana deney kohortuna ayrılmıştır:

• Akciğer inflamasyonu ve fibrozisi kohortu,
• Deri inflamasyonu ve fibrozisi kohortu.

Her kohortta üç grup bulunmaktadır:

• Kontrol,
• Bleomisin,
• Bleomisin + α-KG.

Her grupta 16 fare yer almış; inflamasyon ve fibrozis zaman noktalarında sekizer hayvan değerlendirilmiştir. Böylece toplam 96 fare kullanılmıştır.

Akciğer modelinde bleomisin 3 mg/kg dozunda trakea içine tek sefer uygulanmıştır. Fareler bleomisin uygulamasından 7 gün sonra inflamasyon, 21 gün sonra fibrozis açısından değerlendirilmiştir. Genel deney takviminde bu zaman noktaları uyum ve randomizasyon dönemleri nedeniyle 14. ve 28. günlere karşılık gelmektedir.

Deri modelinde farelere üç hafta boyunca her gün 100 µL, 200 µg/mL yoğunlukta bleomisin deri altına verilmiştir. α-KG gruplarına aynı dönemde günlük 50 mg/kg α-KG mideye sonda yoluyla uygulanmıştır. Diğer gruplara eşit hacimde PBS verilmiştir.

Bu doz insan tedavi dozu mudur?

Hayır. Farelere verilen 50 mg/kg doz yalnızca bu deneysel model için kullanılan preklinik dozdur. İnsanlara doğrudan kilogram başına aynı dozun uygulanması bilimsel olarak doğru değildir. Türler arası metabolizma, emilim, dağılım, biyoyararlanım ve güvenlik farklılıkları nedeniyle klinik doz ancak farmakokinetik ve doz artırma çalışmalarıyla belirlenebilir.

Hücre deneylerinde kullanılan madde de doğrudan α-KG değil, hücre zarından geçişi artırılmış dimetil-α-KG formudur. HUVEC deneylerinde 4 mM DM-αKG kullanılmıştır. Bu hücre kültürü konsantrasyonu da bir insan kan düzeyi veya takviye dozu değildir.

Akciğer inflamasyonu üzerindeki etkiler

Bleomisin uygulamasından sonra akciğer dokusunda bağışıklık hücresi infiltrasyonu ve inflamatuvar sinyal aktivasyonu meydana gelmiştir. α-KG tedavisi şu değişikliklerle ilişkilendirilmiştir:

• H&E boyamasında daha az inflamatuvar hücre birikimi,
• F4/80 pozitif makrofaj infiltrasyonunda azalma,
• Akciğer dokusunda Tnf-α, Il-1β ve Il-6 gen ifadelerinde düşüş,
• Serum TNF-α, IL-1β ve IL-6 düzeylerinde azalma,
• p-IKKα/β, p-P65 ve p-P38 düzeylerinde azalma.

IKK ve P65, NF-κB inflamasyon yolunun; p38 ise hücresel stres ve inflamasyon yanıtının önemli bileşenleridir. Bu proteinlerin fosforillenmiş biçimlerinin azalması, α-KG’nin inflamatuvar sinyal iletimini baskıladığı şeklinde yorumlanmıştır.

Bununla birlikte inflamasyonun tamamen ortadan kalktığı gösterilmemiştir. Bulgular, bleomisinin oluşturduğu yanıtın kontrol grubuna doğru kısmen geri çevrildiğini göstermektedir.

Akciğer fibrozisi ve sağkalım sonuçları

Bleomisin grubunda belirgin kilo kaybı görülmüş, α-KG verilen grupta bu kayıp hafiflemiştir. Yirmi bir günlük gözlem döneminde bleomisin grubundaki hayvanların %37,5’i ölmüş, kontrol ve bleomisin+α-KG gruplarında ölüm gözlenmemiştir.

İlgili zaman noktasında sekiz farelik grup kullanıldığı dikkate alındığında %37,5 oranı üç hayvana karşılık gelmektedir. Log-rank testi deney grupları arasında anlamlı fark göstermiştir. Ancak bu küçük hayvan sayısıyla elde edilen sonuç, etki büyüklüğü bakımından dikkat çekici olsa da bağımsız ve daha büyük deneylerde doğrulanmalıdır.

Masson boyaması, bleomisin akciğerlerinde yoğun mavi kollajen birikimi olduğunu göstermiştir. α-KG grubunda kollajenle boyanan alan belirgin biçimde azalmıştır.

Fibrozisle ilişkili başlıca göstergelerde şu örüntü görülmüştür:

• Tgfb1: Bleomisinle arttı, α-KG ile azaldı.
• Col1a1: Bleomisinle arttı, α-KG ile azaldı.
• Fn1: Fibronektin gen ifadesi bleomisinle arttı, α-KG ile azaldı.
• α-SMA: Miyofibroblast aktivasyon göstergesi yükseldi, tedaviyle geriledi.
• p-Smad2: Histolojik boyanma tedaviyle azaldı; Western blot düzeyindeki değişim daha zayıftı.

α-SMA neyi gösterir?

α-SMA, alfa-düz kas aktini olarak adlandırılan bir proteindir. Normal fibroblastlar doku hasarı sırasında miyofibroblast adı verilen daha kasılabilir ve yoğun matriks üreten hücrelere dönüşebilir. α-SMA artışı bu dönüşümün yaygın göstergelerinden biridir.

α-SMA’nın azalması, miyofibroblast aktivitesinin gerilediğini düşündürür; ancak tek başına fibrozisin tamamen geri döndüğünü göstermez.

Akciğer transkriptomu nasıl değişti?

Akciğer dokularından yapılan bulk RNA dizilemesi, kontrol, bleomisin ve bleomisin+α-KG gruplarının birbirinden ayrılan gen ifade profillerine sahip olduğunu göstermiştir.

İnflamasyon evresinde bleomisin:

• 7.473 geni artırmış,
• 2.375 geni azaltmıştır.

Çalışmada 2.255 genin α-KG ile tersine çevrildiği belirtilmektedir. Bu sayı, bleomisinle yükselen 7.473 genin yaklaşık %30’una karşılık gelmektedir.

Bleomisin; IL-3, IL-5 ve IL-17A gibi inflamatuvar programları artırırken oksidatif fosforilasyon ve yağ asidi biyosentezi gibi metabolik yolları baskılamıştır. α-KG, inflamatuvar sinyalleri azaltıp metabolik yolları yeniden güçlendiren ters yönlü bir profil oluşturmuştur.

Fibrozis döneminde değerlendirilen 3.637 bleomisinle bozulmuş genin 1.078’i α-KG tarafından anlamlı biçimde tersine çevrilmiştir. Bu oran yaklaşık %29,6’dır.

Yolak analizlerinde bleomisin şu programları artırmıştır:

• Sitokin-sitokin reseptörü etkileşimleri,
• NF-κB ve p53 sinyali,
• Kompleman ve koagülasyon kaskatları,
• Hücre döngüsü ve proteazom aktivitesi,
• İnflamatuvar ve proliferatif programlar.

Buna karşılık retinol, triptofan, dallı zincirli amino asit ve sitokrom P450 aracılı metabolizma gibi oksidatif yollar baskılanmıştır. α-KG uygulaması bu yolakların önemli bölümünde yaklaşık ayna görüntüsü oluşturan bir tersine dönüş sağlamıştır.

Serum proteomiği ne ekledi?

Olink hedefli proteomik yöntemiyle fare serumundaki inflamasyonla ilişkili proteinler incelenmiştir. Yüksek eksikliği bulunan dört analiz çıkarıldıktan sonra 90 protein değerlendirilmiştir.

Bleomisin kontrol grubuna göre 26 proteini artırmış, sekiz proteini azaltmıştır. Artan proteinler arasında Itgb6, Eda2r, IL-6, CCL20, Fst ve IL-10 yer almıştır.

α-KG, bleomisinle artan proteinlerin onunu tersine çevirmiştir. Bunlar arasında:

• CCL20,
• IL-10,
• Eda2r,
• Gdnf,
• Pla2g4a bulunmaktadır.

Bleomisinle azalan Dll1, Epcam, Epo, Flrt2 ve Vsig2 proteinleri ise α-KG ile yeniden yükselmiştir. Bu örüntü transkriptomik sonuçlarla birlikte değerlendirildiğinde, α-KG’nin yalnızca doku içindeki gen ifadesini değil dolaşımdaki inflamatuvar protein profilini de etkilediğini düşündürmektedir.

Tek hücreli RNA dizilemesi neyi araştırdı?

Bulk RNA dizilemesi akciğer dokusundaki bütün hücrelerin ortalama sinyalini verir. Ancak akciğer; bağışıklık hücreleri, fibroblastlar, endotel hücreleri ve alveol hücreleri gibi çok sayıda hücre türünden oluşur. Tek hücreli RNA dizilemesi, bu hücreleri ayrı ayrı incelemeyi mümkün kılar.

Kontrol, bleomisin ve bleomisin+α-KG gruplarından ikişer akciğer olmak üzere toplam altı akciğer analiz edilmiştir. Kalite kontrolünden sonra 29.434 hücre değerlendirilmiştir.

Dokuz ana hücre topluluğu tanımlanmıştır:

• B hücreleri,
• T hücreleri,
• NK hücreleri,
• Miyeloid hücreler,
• Nötrofiller,
• Endotel hücreleri,
• Fibroblastlar,
• Alveoler tip 2 hücreleri,
• Mast hücreleri.

Fibroblast aktivasyon skoru bleomisinle yükselmiş, α-KG ile gerilemiştir. Alt küme analizinde özellikle Npnt pozitif fibroblastlarda bleomisinle artan aktivasyonun α-KG ile azaldığı görülmüştür. Dcn pozitif fibroblastlarda ise aynı derecede belirgin bir değişim bulunmamıştır.

Endotel hücreleri neden araştırmanın merkezine yerleşti?

α-KG ile bleomisin grupları karşılaştırıldığında en fazla farklı ifade edilen gene sahip hücre türü endotel hücreleri olmuştur. Analizde 2.045 endotel hücresi bulunmasına rağmen, bu hücrelerdeki transkriptomik yanıt diğer hücre gruplarından daha geniştir.

Bu sonuç, endotel hücrelerinin α-KG’nin başlıca hücresel hedeflerinden biri olabileceğini düşündürmüştür. Ancak “en fazla değişen gen sayısı”, ilacın doğrudan yalnızca bu hücrelerde etkili olduğunu kanıtlamaz. Değişimler diğer hücrelerden gelen sinyallerin dolaylı sonucu da olabilir.

Endotel hücreleri üç alt gruba ayrılmıştır:

Gruplar arasında bu üç alt kümenin oranlarında anlamlı değişim görülmemiştir. Bu nedenle α-KG’nin endotel alt tiplerinin sayısını değiştirmekten çok, mevcut endotel hücrelerinin işlevini ve metabolik durumunu değiştirdiği düşünülmüştür.

Endotel hücre oranı gerçekten arttı mı?

Tek hücreli analizde grup başına yalnızca iki akciğer bulunduğu için doğrudan hücre oranı karşılaştırmalarının güvenilirliği sınırlıdır. Araştırmacılar bu nedenle tek hücreli veriyi referans olarak kullanıp bulk RNA dizilemesi üzerinde BisqueRNA dekonvolüsyonu uygulamıştır.

Bu hesaplamalı analiz:

• Bleomisinin endotel hücresi oranını azalttığını,
• Miyeloid hücreleri ve nötrofilleri artırdığını,
• α-KG’nin tahmini endotel oranını yükselttiğini,
• Miyeloid hücre oranını azalttığını göstermiştir.

Buradaki “oran”, hücrelerin doğrudan mikroskopla sayılması değil; gen ifade karışımından hesaplanan tahmini hücre bileşimidir. CD31 boyamasındaki iyileşme bu sonucu desteklemektedir, fakat mutlak endotel hücre sayısının arttığını tek başına kanıtlamaz. CD31 ifadesinin hücre başına yükselmesi de sonuca katkıda bulunabilir.

Yağ asidi metabolizmasının önemi

Arteriyel endotel hücrelerinde bleomisin, yağ asidi omega oksidasyonu ve sitokrom P450 aracılı oksidasyon yolaklarını baskılamıştır. α-KG bu iki yolaktaki aktivite skorlarını yeniden yükseltmiştir.

Endotel hücreleri yağ asitlerini yalnızca enerji üretmek için kullanmaz. Yağ asidi oksidasyonundan elde edilen metabolik ara ürünler, hücre çoğalması sırasında gerekli nükleotidlerin üretimine de katkı sağlayabilir. Metabolik baskılanma, endotel hücresinin yeni damar oluşturma ve bariyer bütünlüğünü koruma kapasitesini azaltabilir.

Çalışmanın önerdiği mekanizma şu şekilde özetlenebilir:

\[ \alpha\text{-KG} \rightarrow Endotel\ metabolizmasının\ korunması \rightarrow Anjiyogenez\ ve\ bariyer\ işlevinin\ iyileşmesi \rightarrow Hipoksi\ ve\ fibroblast\ aktivasyonunun\ azalması \]

Bu zincirin ilk bölümleri hücre ve omik deneylerle desteklenmektedir. Endotel iyileşmesinin doğrudan doku hipoksisini azalttığı ve bunun fibrozu gerilettiği ise aynı deneyde kesintisiz biçimde gösterilmemiştir; mekanistik bir çıkarımdır.

HUVEC deneyleri ne gösterdi?

İnsan göbek kordonu ven endotel hücreleri dört koşulda incelenmiştir:

• Kontrol,
• DM-αKG,
• Bleomisin,
• Bleomisin + DM-αKG.

Bleomisin hücre canlılığını azaltırken DM-αKG birlikte uygulandığında canlılık kontrol düzeyine yaklaşmıştır.

Hücre göçü, tek tabaka hâlindeki endotel hücrelerine çizik oluşturulan yara iyileşme deneyiyle ölçülmüştür. Çalışmada kullanılan denklem şöyledir:

\[ Yara\ kapanması\ (\%) = \frac{Alan_{0\ saat}-Alan_{24\ saat}}{Alan_{0\ saat}} \times 100 \]

Burada:

• Alan_{0 saat}, çizik oluşturulduğu andaki boş alanı,
• Alan_{24 saat}, 24 saat sonra kalan boş alanı ifade eder.

Değer yükseldikçe hücrelerin boşluğu daha hızlı kapattığı, yani göç kapasitesinin daha iyi olduğu kabul edilir. Bleomisin yara kapanmasını belirgin biçimde azaltmış, DM-αKG bu bozukluğu kısmen geri çevirmiştir.

Matriks üzerinde yapılan tüp oluşumu deneyinde bleomisin hem tamamlanmış tüp sayısını hem de toplam tüp uzunluğunu azaltmıştır. α-KG birlikte verildiğinde bu iki anjiyogenez göstergesi yeniden yükselmiştir.

Endotel bariyeri nasıl değerlendirildi?

Endotel hücrelerinin birbirine sıkı biçimde bağlanması, damar içindeki sıvı ve moleküllerin kontrolsüz biçimde dokuya sızmasını önler. Çalışmada üç temel protein incelenmiştir:

• eNOS: Damar tonusu ve endotel homeostazında görev alan nitrik oksit üretici enzim.
• ZO-1: Hücreler arası sıkı bağlantı kompleksini düzenleyen protein.
• Occludin: Sıkı bağlantı bariyerinin yapısal proteinlerinden biri.

Bleomisin bu proteinlerin düzeyini azaltmış, α-KG ise eNOS, ZO-1 ve Occludin düzeylerini yeniden yükseltmiştir. Ayrıca ICAM-1 ve VCAM-1 gibi bağışıklık hücrelerinin damar yüzeyine tutunmasını kolaylaştıran adezyon moleküllerinin gen ifadeleri α-KG ile azalmıştır.

Bu bulgular α-KG’nin endotel hücrelerinde aynı anda:

• İnflamatuvar aktivasyonu azaltabileceğini,
• Hücre göçünü destekleyebileceğini,
• Yeni damar benzeri yapı oluşturma kapasitesini koruyabileceğini,
• Bariyer bütünlüğünü güçlendirebileceğini düşündürmektedir.

Mitokondrilerde ne değişti?

Elektron mikroskobu görüntülerinde bleomisin grubundaki mitokondrilerde iç zar kıvrımları olan kristaların parçalandığı ve mitokondri matriksinin şiştiği bildirilmiştir. α-KG grubunda krista yapısı daha iyi korunmuş ve mitokondri yoğunluğu artmıştır.

Western blot analizinde NRF1 proteini α-KG ile yükselmiştir. NRF1, mitokondri biyogenezi ve oksidatif metabolizmayla ilişkili genlerin düzenlenmesinde görev alan transkripsiyon faktörüdür.

Ancak çalışmada:

• Oksijen tüketim hızı,
• ATP üretimi,
• Mitokondriyal membran potansiyeli,
• Gerçek yağ asidi oksidasyon akışı doğrudan ölçülmemiştir.

Dolayısıyla mitokondri işlevinin yeniden kurulduğu sonucu; transkriptomik yolak skorları, elektron mikroskobu ve NRF1 düzeyinin ortak yorumuna dayanmaktadır. Enerji üretiminin işlevsel olarak tamamen düzeldiği henüz gösterilmemiştir.

Deri fibrozisi modelinin sonuçları

Sistemik sklerozun ayırt edici özelliklerinden biri deri kalınlaşmasıdır. Araştırmacılar akciğer sonuçlarının başka bir hedef organda da görülüp görülmediğini test etmek için deri fibrozisi modeli kullanmıştır.

Bleomisin uygulaması:

• Serum TNF-α, IL-1β ve IL-6 düzeylerini artırmış,
• Deri kalınlığını yükseltmiş,
• F4/80 pozitif makrofaj infiltrasyonunu artırmış,
• Kollajen birikimini belirginleştirmiş,
• COL1A1 ve p-Smad2 boyanmasını yükseltmiştir.

Oral α-KG bu değişikliklerin tamamını anlamlı biçimde azaltmıştır. Masson boyamasında mavi kollajen alanlarının küçüldüğü, deri kalınlığının kontrol düzeyine yaklaştığı ve makrofaj birikiminin belirgin biçimde gerilediği görülmektedir.

Bu bulgu, α-KG’nin yalnızca bleomisinle hasarlanan akciğerde değil, deri dokusunda da antiinflamatuvar ve antifibrotik bir deneysel etki oluşturduğunu göstermektedir.

Çalışmanın literatürde cevap verdiği boşluk

Daha önce α-KG’nin kalp ve karaciğer fibrozisi modellerindeki etkileri araştırılmış; sistemik skleroz deri örneklerinde dimetil-α-KG’nin ex vivo antiinflamatuvar yanıt oluşturabileceği bildirilmişti.

Bu çalışmanın kendi değerlendirmesine göre getirdiği yenilikler şunlardır:

• Endojen α-KG düzeyinin sistemik sklerozla ilişkili deneysel fibroziste nasıl değiştiğinin gösterilmesi,
• Ağızdan α-KG uygulanmasının hem akciğer hem deri fibrozisi modelinde test edilmesi,
• Tek hücreli ve bulk transkriptomiğin birlikte kullanılması,
• Endotel hücrelerinin ve özellikle arteriyel endotel alt grubunun temel yanıt veren hücreler olarak belirlenmesi,
• Endotel bariyeri, anjiyogenez, mitokondri ultrastrüktürü ve metabolik yolakların aynı deney çerçevesinde incelenmesi.

Fibroblast merkezli fibrozis anlayışı neden genişliyor?

Fibroziste aşırı kollajeni doğrudan üreten başlıca hücreler fibroblastlar ve miyofibroblastlardır. Bu nedenle birçok çalışma doğal olarak fibroblastlara odaklanır.

Ancak fibroblast aktivasyonu boşlukta gerçekleşmez. Endotel hasarı:

• Dokuya oksijen taşınmasını azaltabilir,
• Damar geçirgenliğini bozabilir,
• Bağışıklık hücresi girişini artırabilir,
• Fibroblastları uyaran büyüme faktörlerinin salınmasını etkileyebilir,
• Normal doku yenilenmesini sınırlandırabilir.

Bu çalışma fibroblastların önemini reddetmemektedir. Fibroblast aktivasyon skorunun α-KG ile düştüğünü göstermektedir. Asıl yenilik, fibroblast yanıtının kısmen endotel metabolizmasının ve damar bütünlüğünün korunması üzerinden şekillenebileceği önerisidir.

Gündelik yaşam ve gelecekteki klinik önem

Sistemik skleroz hastalarında deri sertliği el hareketlerini, giyinmeyi, beslenmeyi ve günlük işlevleri güçleştirebilir. Akciğer fibrozisi ise nefes darlığı, egzersiz kapasitesinde azalma ve ilerleyici solunum yetmezliğiyle sonuçlanabilir.

Endotel işlevini ve metabolik homeostazı aynı anda hedefleyen bir tedavi yaklaşımı, teorik olarak yalnızca kollajen üretimini azaltmakla kalmayıp fibrozisi başlatan damar hasarını da sınırlayabilir. Bu, çalışmanın geleceğe dönük en önemli düşünsel katkısıdır.

Bununla birlikte araştırma, α-KG’nin insanlarda deri kalınlığını, akciğer fonksiyonunu, yaşam kalitesini veya sağkalımı iyileştirdiğini göstermemektedir. Klinik etki için önce ek hayvan modelleri, hasta kaynaklı hücre ve dokular, toksikoloji, farmakokinetik ve daha sonra kontrollü insan çalışmaları gereklidir.

Çalışmanın güçlü yönleri

• Fibrozis hem deri hem akciğer modelinde incelenmiştir.
• Toplam 96 fareyle iki ayrı organ kohortu oluşturulmuştur.
• İnflamasyon ve yerleşmiş fibrozis farklı zaman noktalarında değerlendirilmiştir.
• Hedefli metabolomik, bulk RNA-seq, tek hücreli RNA-seq ve serum proteomiği birleştirilmiştir.
• Histoloji, immünohistokimya, RT-qPCR ve Western blot sonuçları birlikte kullanılmıştır.
• Endotel hücresi canlılığı, göçü, tüp oluşturması ve bariyer proteinleri işlevsel deneylerle incelenmiştir.
• Tek hücreli verinin sınırlı örnek sayısı, bulk RNA dekonvolüsyonuyla desteklenmeye çalışılmıştır.
• Mitokondri yapısı elektron mikroskobuyla doğrudan görüntülenmiştir.
• Çalışma, bazı mekanistik sınırlılıklarını kendi tartışma bölümünde açıkça kabul etmiştir.
• Fare deneyleri etik kurul onayı ve ARRIVE ilkeleri kapsamında yürütülmüştür.

Çalışmanın sınırlılıkları

• Hakemlik eksikliği: Çalışma henüz bağımsız bilimsel hakem değerlendirmesinden geçmemiştir.
• İnsan çalışması değildir: Sistemik skleroz hastalarında etkinlik veya güvenlik değerlendirilmemiştir.
• Bleomisin modelinin sınırı: Model, insan SSc’sindeki kronik otoimmün yanıtı ve uzun süreli vaskülopatiyi bütünüyle taklit etmez.
• Yalnızca erkek fareler: Sistemik sklerozda önemli olan cinsiyet farklılıkları deneysel olarak incelenmemiştir.
• Kısa izlem: Deney yaklaşık üç haftalık fibrozis dönemiyle sınırlıdır; uzun süreli nüks, kalıcılık ve güvenlik bilinmemektedir.
• Küçük sağkalım grubu: %37,5 ölüm farkı ilgili zaman noktasındaki yaklaşık sekiz hayvan üzerinden hesaplanmıştır.
• Tek hücreli örneklem küçüktür: scRNA-seq analizinde grup başına yalnızca iki akciğer bulunmaktadır.
• Hücre oranları hesaplamalıdır: Endotel oranının düzelmesi esas olarak bulk RNA dekonvolüsyonuna dayanmaktadır.
• HUVEC modeli: Göbek kordonu ven endotel hücreleri erişkin sistemik skleroz akciğerindeki arteriyel veya mikrovasküler endotel hücreleriyle tamamen aynı değildir.
• Farklı α-KG formları: Farelerde α-KG, hücre deneylerinde ise dimetil-α-KG kullanılmıştır.
• Farmakokinetik veri yoktur: Dokudaki α-KG düzeyleri, emilim, yarılanma ömrü ve hedef organdaki etkin konsantrasyon ayrıntılı değerlendirilmemiştir.
• Doz-cevap analizi yoktur: Yalnızca seçilmiş bir hayvan dozu kullanılmıştır.
• Standart tedavi karşılaştırması yoktur: α-KG mevcut antifibrotik veya immün baskılayıcı tedavilerle karşılaştırılmamıştır.
• Doğrudan mitokondri işlevi ölçülmemiştir: Oksijen tüketimi ve ATP üretimi değerlendirilmemiştir.
• Telafi hipotezi çıkarımsaldır: Endojen α-KG yükselişinin koruyucu bir yanıt olduğu doğrudan genetik veya metabolik akış deneyiyle kanıtlanmamıştır.
• Bazı protein sonuçları uyumlu değildir: TGF-β/Smad baskılanmasını destekleyen genel veri olmasına rağmen her Western blot karşılaştırması istatistiksel anlamlılık göstermemiştir.
• RNA-seq yöntem açıklaması belirsizdir: Metinde aynı analiz akışında hem Kallisto hem RSEM’den söz edilmesi yeniden üretilebilirlik açısından açıklama gerektirmektedir.
• Hasta dokusunda doğrulama yoktur: Bulgular sistemik skleroz hastalarından alınan akciğer, deri veya endotel hücrelerinde doğrulanmamıştır.

Çalışma ne söylüyor?

• α-KG, bleomisinle fibrotik hâle getirilen fare akciğerlerinde ve TGF-β ile aktive edilen fibroblastlarda yükselmiştir.
• Dışarıdan α-KG verilmesi, fibroblastlardaki kollajen artışını azaltmıştır.
• Oral α-KG, farelerde bleomisine bağlı akciğer inflamasyonu ve fibrozisini hafifletmiştir.
• Deneysel akciğer modelinde α-KG verilen grupta ölüm görülmemiştir.
• α-KG, deri kalınlaşmasını ve dermal kollajen birikimini azaltmıştır.
• α-KG, inflamatuvar sitokinleri ve bazı NF-κB/p38 sinyallerini baskılamıştır.
• Tek hücreli analiz endotel hücrelerini en geniş transkriptomik yanıt veren hücre grubu olarak göstermiştir.
• Özellikle arteriyel endotel hücrelerinde yağ asidi ve sitokrom P450 ilişkili metabolik yollar düzelmiştir.
• HUVEC deneylerinde hücre canlılığı, göç, tüp oluşumu, eNOS ve bariyer proteinleri iyileşmiştir.
• Mitokondri krista yapısı korunmuş ve NRF1 düzeyi yükselmiştir.
• α-KG, ileri araştırma gerektiren preklinik bir antifibrotik adaydır.

Çalışma ne söylemiyor?

• α-KG’nin insan sistemik sklerozunu tedavi ettiğini göstermemektedir.
• Besin takviyesi olarak satılan α-KG ürünlerinin aynı etkiyi oluşturacağını göstermemektedir.
• Fare dozunun insanlarda güvenli veya etkili olacağını göstermemektedir.
• α-KG’nin mevcut tedavilerin yerine kullanılabileceğini göstermemektedir.
• Yerleşmiş insan akciğer fibrozisini geri çevirdiğini kanıtlamamaktadır.
• Endotel hücrelerinin α-KG’nin tek veya doğrudan hedefi olduğunu kesinleştirmemektedir.
• Endojen α-KG artışının kesin olarak koruyucu olduğunu kanıtlamamaktadır.
• Mitokondriyal ATP üretiminin tamamen düzeldiğini göstermemektedir.
• Uzun süreli toksisite, üreme güvenliği veya ilaç etkileşimleri hakkında kanıt sunmamaktadır.
• Sistemik skleroz hastalarının hekim kontrolü dışında α-KG kullanmasını destekleyen klinik kanıt sağlamamaktadır.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

Deneysel tasarımın teknik özeti

Başlıca deneysel bulgular

Önerilen mekanizmanın düzenli özeti

İstatistiksel yaklaşım

Hücre deneyleri ortalama ± standart hata, hayvan deneyleri ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur. İki grup karşılaştırmalarında iki yönlü Student t-testi; üç veya daha fazla grupta tek yönlü varyans analizi ve Tukey çoklu karşılaştırma testi kullanılmıştır. Sağkalım eğrileri log-rank testiyle karşılaştırılmıştır.

Tek hücreli diferansiyel ifade analizinde kullanılan eşikler:

\[ |\log_2FC| > 0{,}5 \quad ve \quad Düzeltilmiş\ P < 0{,}01 \]

log₂FC, iki grup arasındaki gen ifade değişiminin iki tabanındaki logaritmasıdır. Değerin 0,5’in üzerinde olması ifadenin yaklaşık 1,41 kattan fazla arttığını; -0,5’in altında olması yaklaşık 1,41 kattan fazla azaldığını gösterir.

Olink proteomik analizinde diferansiyel proteinler için FDR<0,05 ve mutlak ΔNPX>log₂(1,2) eşikleri kullanılmıştır. Çoklu testlerden kaynaklanabilecek yanlış pozitifleri sınırlamak için Benjamini-Hochberg düzeltmesi uygulanmıştır.

Kaynak ve Yöntem Notu

Bu içerik, Yanting Wu, Shikai Ye, Huanling Chen, Jiahui Li, Xiang Pan, Huajuan Yan, Xiangzhen Kong, Haiyan Chu, Qingmei Liu, Jun Bian, Zhenglong Gu ve Weilin Pu tarafından hazırlanan “Alpha-ketoglutarate ameliorates systemic sclerosis-associated fibrosis by restoring endothelial function and metabolic homeostasis” başlıklı çalışmaya dayanmaktadır.

Çalışma SSRN üzerinde yayımlanan bir preprinttir. Metinde açıkça “This preprint research paper has not been peer reviewed” ifadesi bulunmaktadır. Dolayısıyla çalışma bağımsız bilimsel hakem değerlendirmesinden geçmemiştir; yöntemler, analizler ve yorumlar sonraki sürümlerde değişebilir.

Araştırma insanlarda yürütülmüş klinik çalışma değildir. Sonuçlar; bleomisinle oluşturulan fare deri ve akciğer fibrozisi modellerine, insan fibroblast ve HUVEC hücre kültürlerine, hedefli metabolomik, bulk ve tek hücreli RNA dizileme, serum proteomiği ve elektron mikroskobu analizlerine dayanmaktadır.

Fare deneyleri Greater Bay Area Institute of Precision Medicine etik kurulu tarafından IPMGBA-23-0012 numarasıyla onaylanmıştır. Çalışmada toplam 96 erkek C57BL/6 fare kullanılmıştır. Yazarlar çıkar çatışması bildirmemiştir. Çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı ve metinde ayrıntıları verilen çeşitli ulusal ve bölgesel araştırma programlarınca desteklenmiştir.

α-KG’nin insanlar tarafından besin takviyesi olarak daha önce kullanılmış olması, bu çalışmadaki sistemik skleroz etkinliğinin insanlar için kanıtlandığı anlamına gelmez. Kullanılan fare dozu, hücre kültürü konsantrasyonu ve dimetil-α-KG formu klinik kullanım önerisine dönüştürülemez.

Bleomisin modeli insan sistemik sklerozunun otoimmün yapısını, kronik damar hastalığını ve uzun süreli organ ilerlemesini tam olarak temsil etmez. Araştırmacılar da hasta kaynaklı dokular, farklı sistemik skleroz modelleri, doğrudan mitokondri işlev testleri ve klinik değerlendirmeler gerektiğini belirtmiştir.

Bu içerik yalnızca yüklenen çalışmanın yöntemleri, şekilleri, histolojik görüntüleri, moleküler analizleri, sayısal bulguları, yazar yorumları ve sınırlılıklarına dayanarak hazırlanmıştır. Çalışmada bulunmayan klinik tedavi başarısı, güvenli insan dozu, hastalığı iyileştirme garantisi veya takviye kullanım önerisi eklenmemiştir.