Bu araştırmanın temel problemi, opioid kullanımının toplum düzeyinde izlenebilmesi için güvenilir, hassas ve yaygın laboratuvarlarda uygulanabilir yöntemlere ihtiyaç duyulmasıdır. Opioid krizi özellikle sentetik opioidlerin, örneğin fentanil ve türevlerinin yaygınlaşmasıyla ciddi bir halk sağlığı sorununa dönüşmüştür. Geleneksel veri kaynakları; anketler, hastane kayıtları, aşırı doz ölümleri, tedavi başvuruları, kolluk verileri ve ele geçirilen madde kayıtları gibi dolaylı veya gecikmeli göstergelere dayanır. Bu kaynaklar önemli olsa da, toplumdaki gerçek kullanım eğilimlerini her zaman zamanında, tarafsız ve ayrıntılı biçimde yansıtmayabilir.

Atıksu temelli epidemiyoloji bu boşluğu doldurmak için gelişen bir yaklaşımdır. Bir bölgenin kanalizasyon sistemine karışan atıksu, o bölgede yaşayan insanların dışkı ve idrar yoluyla attığı ilaç metabolitlerini, kimyasalları ve biyolojik izleri içerebilir. Bu örnekler analiz edildiğinde bireyleri değil, topluluk düzeyindeki eğilimleri anlamak mümkün olur. Bu nedenle WBE, opioid kullanımı gibi halk sağlığı açısından kritik konularda erken uyarı, bölgesel izleme ve kaynak planlama için değerli bir araç olabilir.

Ancak atıksuda opioid analizi teknik olarak zordur. Hedef bileşikler çoğu zaman ng/L ya da ppt düzeyinde bulunur. Atıksu matriksi ise oldukça karmaşıktır: organik madde, tuzlar, deterjan kalıntıları, biyolojik parçacıklar, diğer ilaçlar ve farklı kimyasal girişimler aynı örnekte bulunabilir. Bu karmaşık zemin içinde çok düşük miktardaki opioid metabolitlerini güvenilir biçimde ayırmak, tanımak ve ölçmek yüksek duyarlılık gerektirir.

Bu çalışmanın önemi burada ortaya çıkar. Literatürde ppt düzeyindeki analizler çoğu zaman yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi yani HRMS veya premium seviye triple quadrupole sistemlerle ilişkilidir. Bu cihazlar çok güçlüdür; fakat pahalıdır, teknik uzmanlık gerektirir ve her halk sağlığı veya çevre izleme laboratuvarında bulunmayabilir. Araştırmacılar bu nedenle daha erişilebilir bir soru sormaktadır: Orta seviye bir triple quadrupole LC-MS/MS sistemiyle, doğru örnek hazırlama ve ölçüm optimizasyonu yapılırsa ppt düzeyinde opioid ölçümü mümkün olabilir mi?

Çalışmanın yanıtı, belirli koşullar altında evettir. Yazarlar SCIEX Triple Quad 3500 gibi orta seviye kabul edilebilecek bir triple quadrupole platform üzerinde, SPE zenginleştirme, %100 suda yeniden çözündürme, büyük hacimli enjeksiyon ve scheduled MRM stratejisini birleştirerek yüksek duyarlılık elde etmiştir.

Çalışmada hedeflenen yedi analit şunlardır:

• Morfin: Hem doğrudan kullanılan bir opioid analjezik hem de eroin metabolizmasıyla ilişkili önemli bir gösterge olarak ele alınır.
• M3G, morfin-3-glukuronid: Morfinin karaciğerde glukuronidasyonla oluşan metabolitlerinden biridir.
• M6G, morfin-6-glukuronid: Morfinin bir diğer glukuronid metabolitidir ve yapısal olarak M3G’ye çok benzer.
• Norfentanil: Fentanilin başlıca metabolitlerinden biridir ve sentetik opioid maruziyeti açısından önemli bir göstergedir.
• Noroksikodon: Oksikodon metabolizmasıyla ilişkili bir metabolittir.
• Metadon: Ağrı yönetimi ve opioid bağımlılığı tedavisinde kullanılan sentetik opioiddir; kötüye kullanım potansiyeli nedeniyle izleme paneline alınmıştır.
• EDDP: Metadonun temel metabolitidir ve opioid ikame tedavisi veya metadon maruziyeti bağlamında önemli bir atıksu göstergesi olarak kullanılır.

Bu panelin seçimi, çalışmanın yalnızca “hangi bileşikler ölçülebilir?” sorusuna değil, WBE açısından “hangi metabolitler toplum düzeyinde anlamlı gösterge olabilir?” sorusuna da odaklandığını gösterir. Özellikle glukuronid metabolitlerinin dahil edilmesi önemlidir; çünkü bu metabolitler polar, yapısal olarak benzer ve atıksu matriksinde düşük derişimlerde bulunabilen zor analitlerdir.

Çalışmanın analitik akışında ilk kritik aşama kalibrasyon ve kalite kontrol hazırlığıdır. Ana stok çözelti her analit için 2.000 ng/mL derişimde hazırlanmıştır. Seri seyreltmeyle 0,008–2.000 ng/mL arasında 19 noktalı kalibrasyon eğrileri oluşturulmuştur. Çoğu analit için 50 µL enjeksiyonda 0–250 ng/mL aralığında doğrusal çalışma aralığı belirlenmiştir. Düşük, orta ve yüksek düzey kalite kontrol örnekleriyle yöntemin performansı değerlendirilmiştir.

Yöntemin kromatografik başarısında örnek çözündürme ortamı belirleyici olmuştur. Çalışmada başlangıçta farklı metanol/su oranları denenmiştir: %100 metanol, 75:25 metanol/su, 50:50 metanol/su, 25:75 metanol/su ve %100 su. LC gradyanının başlangıcı su ağırlıklı olduğu için, örneğin başlangıç mobil fazına uyumlu olması pik şeklini iyileştirmiştir. %100 suda yeniden çözündürme, özellikle morfin, M3G ve M6G için daha keskin pikler ve daha yüksek sinyal vermiştir.

Sayfa 21’deki Şekil 4 bu optimizasyonu görsel olarak açık biçimde gösterir. Farklı başlangıç çözgen bileşimlerinde alınan kromatogramlar karşılaştırılır. Metanol oranı yüksek olduğunda bazı analitlerde pik önü yayılması, kuyruklanma veya düşük sinyal görülürken, %100 su koşulunda morfin ve glukuronid metabolitlerinde daha düzgün ve daha güçlü pikler elde edilmiştir. Bu görsel, yöntemin duyarlılığının yalnızca kütle spektrometresinden değil, örneğin hangi çözgende enjekte edildiği gibi basit görünen ama kritik bir kromatografik parametreden de etkilendiğini gösterir.

İkinci kritik aşama katı faz ekstraksiyonudur. Atıksu örnekleri pH 2,5’e asitlendirilmiş, böylece analitlerin kararlılığı ve Strata-XC polimerik sorbent kartuşa tutunması iyileştirilmiştir. Kartuşlar metanol ve asitlendirilmiş suyla koşullandırılmış; örnekler vakum altında yüklenmiş; kartuşlar suyla yıkanmış, vakum altında kurutulmuş ve analitler %2 amonyak içeren metanol ile elüe edilmiştir. Elüatlar 40 °C’de azot altında kurutulmuş ve analiz öncesinde HPLC dereceli su içinde yeniden çözündürülmüştür.

Scheme 1, yani şematik iş akışı, SPE sonrasındaki yeniden çözündürme yaklaşımını görselleştirir. Şemada 50 mL örneğin SPE’den geçirilerek daha küçük hacimli ekstrakta dönüştürülmesi, kurutma/yeniden çözündürme ve farklı çözgen koşullarında analiz tüplerinin hazırlanması gösterilir. Bu şema, yöntemin temel mantığını özetler: büyük hacimli çevresel örnekten hedef analitleri yoğunlaştırmak, ardından cihazda daha yüksek enjeksiyon hacmiyle duyarlılığı artırmak.

Bu noktada önemli bir denge vardır. Çalışmada %100 suda yeniden çözündürmenin bazı analitlerin geri kazanımını düşürdüğü belirtilmiştir. Fakat aynı işlem 5 µL yerine 50 µL enjeksiyona olanak vermiştir. Yani mutlak geri kazanımda %10–40 düzeyinde azalma olsa bile, enjeksiyon hacmindeki 10 kat artış toplam sinyal açısından net avantaj sağlamıştır. Bu, analitik kimyada sık görülen bir optimizasyon gerçeğini gösterir: En iyi yöntem, tek bir parametrenin en yüksek olduğu yöntem değil; duyarlılık, pik şekli, geri kazanım, tekrarlanabilirlik ve matriks toleransı arasında en iyi dengeyi kuran yöntemdir.

Kütle spektrometresi yöntemi pozitif elektrospray iyonizasyon yani ESI pozitif modda geliştirilmiştir. Her analit için multiple reaction monitoring, yani MRM geçişleri optimize edilmiştir. MRM, triple quadrupole kütle spektrometrisinde belirli bir ana iyonun belirli ürün iyonlarına parçalanmasını izleyerek seçicilik ve duyarlılık sağlar. Bu çalışmada her analit için bir kantitatif ana geçiş ve bir veya iki doğrulayıcı geçiş seçilmiştir.

MRM mantığı basitçe şu şekilde düşünülebilir:

\[ Q1: \text{ana iyon} \rightarrow Q3: \text{ürün iyon} \]

Burada Q1, hedef molekülün belirli kütle/yük oranına sahip ana iyonunu seçer. Çarpışma hücresinde bu iyon parçalanır. Q3 ise belirli ürün iyonunu izler. Bir bileşiğin hem doğru ana iyonu hem de doğru ürün iyonu doğru alıkonma zamanında görülüyorsa, tanımlama daha güvenilir hale gelir.

Sayfa 19’daki Şekil 1, çalışmadaki her opioid veya metabolit için temsilî parçalanma spektrumlarını sunar. EDDP, M6G, M3G, morfin, norfentanil, noroksikodon ve metadon için ana kütleler ve belirgin ürün iyonları gösterilir. Bu şekil, MRM geçişlerinin neden seçildiğini destekleyen parçalanma kanıtı olarak önemlidir. Örneğin M3G ve M6G aynı nominal öncül kütleye çok yakın yapısal izomerlerdir; bu nedenle alıkonma zamanı ve ürün iyon geçişleri birlikte kullanılmadan güvenilir ayrım zorlaşabilir.

Scheduled MRM yöntemi, her analitin yalnızca beklenen alıkonma zamanı çevresindeki zaman penceresinde izlenmesini sağlar. Çalışmada MRM penceresi 40 saniye olarak verilmiştir. Bu yaklaşım, cihazın aynı anda izlemek zorunda olduğu geçiş sayısını azaltır, her geçiş için veri toplama verimliliğini artırır ve sinyal/gürültü oranını iyileştirebilir. Yazarlar, scheduled MRM yönteminin glukuronid metabolitlerinde sinyal/gürültü oranını unscheduled yönteme göre yaklaşık %10 artırdığını belirtmiştir.

LC ayırımı için Kinetex Biphenyl kolon kullanılmıştır. Bu kolon seçimi, yapısal olarak benzer opioid metabolitlerinin ayrımı için önemlidir. Mobil faz A, 2 mM amonyum format içeren LC-MS dereceli sudur. Mobil faz B, 2 mM amonyum format içeren metanoldür. Gradyan 11 dakikalık bir analitik koşu içinde çalışacak şekilde ayarlanmıştır. Başlangıçta %100 A kullanılmış, 4. dakikada %80 A/%20 B, 7–9,5 dakika arasında %100 B, ardından yeniden başlangıç koşullarına dönüş uygulanmıştır. Kolon sıcaklığı 30 °C olarak optimize edilmiştir.

Sayfa 20’deki Şekil 2, analitik standartlarla spike edilmiş bir atıksu örneğinde hedef analitlerin extracted ion chromatogram yani XIC görünümünü gösterir. Norfentanil, noroksikodon, EDDP, metadon, M3G, M6G ve morfin gibi bileşikler ayrılmış pikler halinde temsil edilir. Bu görsel, yöntemin karmaşık atıksu matriksinde hedef analitleri ayırma kapasitesini göstermesi açısından önemlidir.

Sayfa 20’deki Şekil 3 ise aynı tarihte alınmış giriş ve çıkış atıksu örneklerine ait temsilî kromatogramları gösterir. İnfluent yani tesise giren atıksuda ve effluent yani arıtma sonrası çıkan atıksuda hedef analitlerin kantitatif geçişleri izlenmiştir. Bu görsel, yöntemin yalnızca standart çözeltilerde değil, gerçek saha örneklerinde de kullanılabildiğini gösterir.

Doğrusallık sonuçları yöntemin güvenilirliğini destekler. Tablo 3’e göre tüm opioid analitlerinde kalibrasyon eğrileri yüksek doğrusal uyum göstermiştir. R² değerleri morfin için 0,9998; M3G için 0,9999; M6G için 0,9999; norfentanil için 0,999; noroksikodon için 0,9992; EDDP için 0,9992 olarak verilmiştir. R², kalibrasyon eğrisinin ölçülen sinyal ile derişim arasındaki ilişkiyi ne kadar iyi açıkladığını gösterir. 1’e çok yakın değerler, doğrusal kantifikasyon performansının güçlü olduğunu gösterir.

Çalışmanın duyarlılığı alt kantifikasyon limitleriyle gösterilmiştir. Tablo 4’e göre örnek düzeyindeki LOQ değerleri şöyledir:

• Noroksikodon: 0,31 ng/L
• EDDP: 0,61 ng/L
• Morfin: 4,88 ng/L
• M6G: 0,61 ng/L
• M3G: 0,08 ng/L
• Norfentanil: 0,61 ng/L
• Metadon: 9,77 ng/L

Bu değerler, çoğu analit için tek haneli ng/L düzeyinde veya daha iyi ölçüm yapılabildiğini gösterir. M3G için 0,08 ng/L gibi çok düşük bir örnek LOQ değeri raporlanmıştır. Morfin ve metadon için LOQ daha yüksektir, fakat yine de atıksu analizi açısından düşük düzeydedir.

Çalışmada LOQ belirleme mantığı sinyal/gürültü oranına dayanır. Temel ilişki şu şekilde ifade edilebilir:

[ S/N > 10 ]

Burada S sinyali, N ise gürültüyü ifade eder. S/N oranının 10’dan büyük olması, analitin yalnızca tespit edilmediğini, aynı zamanda kabul edilebilir güvenilirlikle nicel olarak ölçülebildiğini gösteren yaygın bir analitik kriterdir.

Yöntem doğruluğu ve kesinliği kalite kontrol örnekleriyle değerlendirilmiş ve ölçümlerin standart kabul kriterleri içinde, nominal değerin ±%15 aralığında olduğu belirtilmiştir. Bu, yöntemin yalnızca hassas değil, aynı zamanda tekrarlanabilir ve kantitatif analiz için uygun olduğunu destekler.

Matriks etkisi değerlendirmesi de önemlidir. Atıksu gibi karmaşık örneklerde aynı analit saf suda ve atıksuda farklı sinyal verebilir. Bu etki iyon baskılanması veya iyon artışı şeklinde görülebilir. Çalışmada deiyonize suya spike edilmiş örneklerle atıksuya spike edilmiş örnekler karşılaştırılmış; kalibrasyon eğrisi büyüklüğü, eğim ve doğrusallık farklarının %5’in altında olduğu belirtilmiştir. Bu, yöntemde matriks etkisinin sınırlı kaldığını gösterir.

Tablo 5, suda yeniden çözündürme sonrasında döteryumlu iç standartların geri kazanımını verir. Noroksikodon-d3 için %23 ± 4,52; EDDP-d3 için %13 ± 3,54; morfin-d3 için %80 ± 2,99; M6G-d3 için %26 ± 10,33; M3G-d3 için %35 ± 6,84; norfentanil-d5 için %56 ± 4,06; metadon-d3 için %24 ± 4,01 geri kazanım bildirilmiştir. Bu değerler bazı analitlerde orta veya düşük mutlak geri kazanımı gösterir. Ancak döteryumlu iç standartlar kullanıldığı için ekstraksiyon kayıpları ve matriks kaynaklı değişkenlik kantifikasyonda telafi edilebilmiştir.

Gerçek atıksu örnekleri Greater Albany, New York bölgesindeki bir atıksu arıtma tesisinden alınmıştır. Toplam altı örnek analiz edilmiştir: aynı haftanın Pazartesi, Perşembe ve Pazar günlerinden birer influent ve effluent örneği. Örnekler daha önceki bir çalışma için toplanmış, plastik şişelerde -20 °C’de saklanmış ve bu yöntemin gerçek dünya uygulanabilirliğini değerlendirmek için kullanılmıştır.

Tablo 6, gerçek örneklerde ölçülen opioid/metabolit derişimlerini ng/L cinsinden verir. Morfin, M3G ve M6G tüm test edilen giriş ve çıkış örneklerinde tespit edilmemiştir. Buna karşılık noroksikodon, EDDP, norfentanil ve metadon farklı düzeylerde bulunmuştur.

Bu değerler, yöntemin gerçek atıksu örneklerinde ng/L düzeyindeki opioid metabolitlerini ayırt edebildiğini gösterir. Ancak çalışmadaki bu sonuçlar doğrudan toplumdaki kesin kullanım miktarlarını hesaplamaya dönüştürülmemiştir. WBE’de tüketim tahmini yapabilmek için atıksu debisi, nüfus eşleştirmesi, metabolit kararlılığı, kanalizasyon içinde bozunma, arıtma tesisi dinamikleri ve dışsal kaynaklar gibi ek faktörler gerekir. Bu çalışma daha çok analitik yöntemin duyarlılığı ve uygulanabilirliği üzerine odaklanmaktadır.

Çalışmada morfin ve glukuronidlerinin gerçek örneklerde bulunmaması iki şekilde yorumlanabilir: Örneklerde bu bileşikler gerçekten ölçülebilir düzeyde olmayabilir veya depolama/bozunma, örnekleme zamanı, kanalizasyon koşulları ve matriks etkileri gibi nedenlerle kantitatif düzeyin altına düşmüş olabilir. Yazarlar bu yokluğu, degradasyon veya örneklerde ölçülebilir derişim bulunmaması ihtimaliyle ilişkilendirmiştir.

Tablo 7, çalışmanın yöntemini daha önceki LC-MS/MS atıksu opioid analiz yöntemleriyle karşılaştırır. Bu çalışmanın öne çıkan noktası; HRMS gerektirmeden, orta seviye SCIEX Triple Quad 3500 platformunda, 50 µL büyük hacimli enjeksiyon ve %100 sulu yeniden çözündürme optimizasyonuyla tek haneli ng/L duyarlılık sunmasıdır. Ayrıca 11 dakikalık analitik çalışma süresi, yöntemin rutin analiz için pratik olabileceğini gösterir.

Bu çalışmanın geçmiş açısından önemi, atıksu temelli epidemiyolojinin halk sağlığı izleme aracı olarak giderek daha fazla ilgi görmesine karşılık, yöntemin yaygınlaştırılmasını sınırlayan cihaz erişimi sorununa odaklanmasıdır. Eğer yüksek duyarlılık yalnızca çok pahalı cihazlarla mümkün olursa, WBE daha az sayıda laboratuvarın yapabildiği sınırlı bir alan olarak kalabilir. Bu çalışma, iyi optimize edilmiş örnek hazırlama ve LC-MS/MS koşullarıyla daha erişilebilir cihazların da güçlü sonuç verebileceğini göstermektedir.

Bugün açısından çalışmanın değeri, opioid krizi gibi hızlı değişen halk sağlığı sorunlarında daha fazla laboratuvarın topluluk düzeyinde çevresel izleme yapabilmesine katkı sunabilecek bir analitik çerçeve sağlamasıdır. Özellikle norfentanil gibi sentetik opioid göstergeleri ve EDDP gibi metadon metabolitleri, WBE çalışmalarında toplum düzeyindeki eğilimleri anlamaya yardımcı olabilir.

Gelecek açısından yöntem, daha geniş opioid panellerine, yeni sentetik opioid metabolitlerine, farklı şehirlerdeki atıksu örneklerine ve uzunlamasına zaman serisi çalışmalarına genişletilebilir. Ayrıca örnekleme stratejileri, stabilite değerlendirmeleri, arıtma sürecindeki giderim oranları ve nüfusa göre normalize edilmiş yük hesaplamalarıyla birleştirildiğinde halk sağlığı planlamasında daha güçlü veri sağlayabilir. Ancak bu çalışma tek başına böyle epidemiyolojik çıkarımlar yapmamaktadır; analitik ölçüm yönteminin duyarlılık ve uygulanabilirliğini göstermektedir.

Gündelik yaşama etkisi doğrudan bireysel test veya kolluk amaçlı izleme değildir. Atıksu temelli epidemiyoloji, etik olarak doğru uygulandığında bireyleri değil, anonim topluluk düzeyindeki eğilimleri izlemeye yöneliktir. Böyle bir yaklaşım, tedavi hizmetlerinin planlanması, zarar azaltma programlarının hedeflenmesi, yeni sentetik opioid dalgalarının erken fark edilmesi veya halk sağlığı kaynaklarının daha doğru yönlendirilmesi gibi alanlarda dolaylı yarar sağlayabilir. Fakat bu yöntem, bireysel kullanım kanıtı, klinik tanı veya cezai izleme aracı olarak yorumlanmamalıdır.

Çalışmanın güçlü yönleri şunlardır: orta seviye triple quadrupole platformda ppt düzeyinde duyarlılık hedeflemesi; SPE ile 100 kat ön deriştirme; %100 suda yeniden çözündürme ve büyük hacimli enjeksiyon stratejisi; scheduled MRM ile glukuronid metabolitleri dahil yapısal olarak benzer analitleri ayırma çabası; yüksek doğrusallık değerleri; gerçek atıksu örneklerinde uygulama; literatür yöntemleriyle karşılaştırmalı değerlendirme.

Sınırlılıkları da açık biçimde görülmelidir. Çalışma hakem değerlendirmesinden geçmemiş preprinttir. Örnek sayısı sınırlıdır; yalnızca Greater Albany bölgesinden aynı haftaya ait altı örnek analiz edilmiştir. Morfin ve glukuronidleri gerçek örneklerde tespit edilmemiştir, bu nedenle yöntemin bu analitlerde gerçek saha pozitifleri üzerinden kapsamlı performansı gösterilmemiştir. Bazı analitlerde suyla yeniden çözündürme sonrası geri kazanım düşüktür. Metadon gibi bazı bileşiklerde örnek LOQ değeri diğerlerine göre daha yüksektir. Ayrıca çalışma, ölçülen derişimlerden toplumsal tüketim miktarı hesaplaması yapmamaktadır.

Sonuç olarak bu araştırma, atıksuda opioid ve metabolit analizinin yalnızca en pahalı kütle spektrometrisi platformlarına bağımlı olmak zorunda olmadığını gösteren önemli bir analitik yöntem geliştirme çalışmasıdır. Asıl katkı, SPE zenginleştirme, sulu yeniden çözündürme, büyük hacimli enjeksiyon ve scheduled MRM optimizasyonunun bir araya geldiğinde orta seviye bir triple quadrupole cihazda bile ppt düzeyinde opioid izlemeyi mümkün kılabileceğini göstermesidir. Ancak sonuçlar preprint statüsündedir ve daha geniş örnek setleriyle, farklı atıksu koşullarıyla ve hakem değerlendirmesiyle güçlendirilmesi gerekir.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

Çalışmanın yöntemi, hedef opioid/metabolit panelinin seçilmesi, standart ve kalite kontrol çözeltilerinin hazırlanması, atıksu örneklerinde SPE ile zenginleştirme, %100 suda yeniden çözündürme, büyük hacimli HPLC-MS/MS enjeksiyonu, scheduled MRM optimizasyonu, kalibrasyon/doğrusallık/LOQ değerlendirmesi, geri kazanım ve matriks etkisi incelemesi ve gerçek atıksu örneklerinin analizi aşamalarından oluşur.

Hedef analit paneli:

LC gradyan profili: Çalışmada 11 dakikalık bir HPLC gradyanı kullanılmıştır.

Bu gradyan, polar glukuronidlerden daha hidrofobik analitlere kadar farklı kimyasal özellikteki bileşiklerin tek koşuda ayrılmasına olanak vermiştir. Kolon sıcaklığı 30 °C olarak belirlenmiş ve pik önü/kuyruklanma sorunları azaltılmıştır.

Scheduled MRM parametreleri: Tablo 1’de çok sayıda kantitatif ve doğrulayıcı geçiş listelenmiştir. Çalışmanın pratik anlamı açısından bazı ana kantitatif geçişler şu şekilde özetlenebilir:

Bu tabloda M3G ve M6G’nin aynı ana kütle civarında olmasına rağmen farklı alıkonma zamanlarıyla ayrılması özellikle önemlidir. Bu ayrım, morfin glukuronidlerinin güvenilir kantifikasyonu için kritik analitik gerekliliktir.

Doğrusallık ve ölçüm aralıkları:

R² değerlerinin 0,999 ve üzerinde olması, yöntem sinyalinin ölçülen derişimle çok güçlü doğrusal ilişki verdiğini gösterir. Bu, kantitatif LC-MS/MS analizleri için temel güvenilirlik göstergelerinden biridir.

Alt kantifikasyon limitleri:

Bu sonuçlar yöntemin ana teknik iddiasını destekler: orta seviye triple quadrupole platformla, özellikle SPE zenginleştirme ve büyük hacimli enjeksiyon sayesinde ng/L hatta bazı analitlerde ng/L altı eşdeğer duyarlılığa ulaşılabilmiştir.

Geri kazanım sonuçları:

Geri kazanımların tüm analitlerde yüksek olmaması, yöntemin dürüstçe görülmesi gereken bir sınırlılığıdır. Buna rağmen büyük hacimli enjeksiyon ve izotop etiketli iç standartlar, nihai kantitatif performansı desteklemiştir.

Gerçek atıksu örneklerinden elde edilen bulgular:

• Altı gerçek atıksu örneği analiz edilmiştir: üç giriş suyu ve üç çıkış suyu.
• Noroksikodon, EDDP, norfentanil ve metadon ölçülebilir düzeylerde bulunmuştur.
• Morfin, M3G ve M6G test edilen örneklerde tespit edilmemiştir.
• EDDP değerleri 53,8–115,1 ng/L arasında değişmiştir.
• Norfentanil değerleri 13,8–32,0 ng/L arasında değişmiştir.
• Metadon değerleri 26,2–98,2 ng/L arasında değişmiştir.
• Ölçülen değerler, yöntemin gerçek atıksu matrikslerinde kullanılabileceğini göstermiştir.

Çalışmada kullanılan ve açıklayıcı olarak önemli olan temel ilişkiler:

[ S/N > 10 ]

Bu ifade, alt kantifikasyon limitinin belirlenmesinde kullanılan sinyal/gürültü kriterini özetler. Sinyal gürültünün en az 10 katı olduğunda analitin güvenilir şekilde ölçülebilir olduğu kabul edilmiştir.

\[ \text{Ön deriştirme faktörü} \approx 100 \]

Bu ifade, SPE adımının örnek düzeyindeki düşük derişimli analitleri yoğunlaştırma etkisini açıklar. Çalışmada örnek LOQ değerleri hesaplanırken bu 100 katlık SPE konsantrasyonu dikkate alınmıştır.

\[ 5\,\mu L \rightarrow 50\,\mu L \]

Bu ifade, enjeksiyon hacminin 10 kat artırıldığını gösterir. %100 sulu yeniden çözündürme, büyük hacimli enjeksiyonu pik şeklini bozmadan mümkün hale getirmiştir.

Çalışmanın genel teknik bulguları:

• SCIEX Triple Quad 3500 gibi orta seviye bir triple quadrupole platformda ppt düzeyinde opioid ve metabolit kantifikasyonu gösterilmiştir.
• %100 su içinde yeniden çözündürme, özellikle morfin, M3G ve M6G için pik şeklini ve sinyal yoğunluğunu iyileştirmiştir.
• 50 µL büyük hacimli enjeksiyon, analitik duyarlılığı artırmıştır.
• SPE ile 100 kat ön deriştirme yöntemin düşük ng/L düzeylerine ulaşmasını sağlamıştır.
• Scheduled MRM, özellikle yapısal olarak benzer glukuronid metabolitleri için seçiciliği ve duyarlılığı desteklemiştir.
• Tüm analitlerde kalibrasyon doğrusallığı güçlüdür ve R² değerleri ≥ 0,999 olarak verilmiştir.
• Matriks etkileri %5’in altında raporlanmıştır.
• Gerçek atıksu örneklerinde noroksikodon, EDDP, norfentanil ve metadon ölçülmüştür.
• Yöntem, WBE uygulamalarının daha erişilebilir cihazlarla yaygınlaştırılabileceğini göstermektedir.

Kaynak ve Yöntem Notu

Bu içerik, Thomas Regan, Ian Riley, Muhit Rana, Pengfei Xie ve Avni A. Argun tarafından hazırlanan “Highly sensitive HPLC-MS/MS quantitation of opioids and morphine glucuronides in wastewater using a mid-range triple quadrupole platform” başlıklı çalışmaya dayanılarak hazırlanmıştır.

Kaynak türü preprint araştırma makalesidir. Metinde açık biçimde “This preprint research paper has not been peer reviewed” ifadesi yer almaktadır. Bu nedenle çalışma hakem değerlendirmesinden geçmemiştir. DOI, nihai dergi kabulü veya hakemlik sürecinin tamamlandığını gösteren bilgi metin üzerinden doğrulanamamaktadır.

Bu makaledeki açıklamalar, çalışmada verilen HPLC-MS/MS yöntem geliştirme süreci, SPE zenginleştirme iş akışı, %100 suda yeniden çözündürme ve büyük hacimli enjeksiyon stratejisi, scheduled MRM parametreleri, kromatogramlar, kalibrasyon/doğrusallık verileri, LOQ sonuçları, geri kazanım değerleri ve Greater Albany, NY bölgesinden gerçek atıksu örnekleri üzerinde yapılan uygulama temel alınarak hazırlanmıştır. PDF’de olmayan halk sağlığı etkisi, klinik tanı, bireysel kullanım tespiti, yasal çıkarım, tedavi başarısı veya kesin epidemiyolojik tüketim hesaplaması eklenmemiştir.

Çalışma klinik çalışma değildir. İnsan hasta grubu, tedavi protokolü, bireysel biyolojik örnek analizi veya klinik tanı değerlendirmesi içermez. Çalışma, çevresel atıksu örneklerinde opioid ve metabolitlerin topluluk düzeyinde izlenmesine yönelik analitik yöntem geliştirme çalışmasıdır. Bu nedenle bulgular bireylerin uyuşturucu kullanımı hakkında bilgi vermez; yalnızca atıksu matriksinde belirli analitlerin ölçülebilirliğini ve yöntemin performansını gösterir.

Çalışmanın en güçlü katkısı, yüksek çözünürlüklü veya premium seviye cihazlar gerektirmeden, orta seviye triple quadrupole LC-MS/MS platformda ppt düzeyinde opioid izlemeye yönelik erişilebilir bir iş akışı önermesidir. Bununla birlikte çalışma sınırlı sayıda gerçek atıksu örneğiyle yapılmıştır; morfin ve glukuronidleri saha örneklerinde tespit edilmemiştir; bazı analitlerde geri kazanım düşüktür. Preprint statüsü nedeniyle bulguların hakem değerlendirmesi sonrasında değişebileceği veya ek doğrulama gerektirebileceği dikkate alınmalıdır.