Панкреастын түтүкчөлүк аденокарциномасын (pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC) эрте баскычта сары суудан аныктоону изилдеген бул эмгекте көмүрсуу антигени 19-9 (CA19-9) деңгээлин өлчөө үчүн Signal-Enhanced Lateral Flow Immunoassay (SELFI) деп аталган сигналы күчөтүлгөн латералдык агымдык иммуноанализ иштелип чыккан. Система кремний диоксиди нанобөлүкчөсүнүн үстүнө көп сандаган алтын нанобөлүкчөлөр жайгаштырылган SiO₂@Au@Au нанозондорундагы нанометр масштабындагы боштуктар жараткан плазмондук “hotspot” аймактарын пайдаланат. SELFI CA19-9 анализин болжол менен 15 мүнөттө аяктап, изилдөөдө 0.012 U mL⁻¹ аныктоо чегине жеткен. Клиникалык сары суу баалоосунда эрте баскычтагы PDAC менен дени сак көзөмөлдөрдү ажыратууда орточо ROC-AUC мааниси SELFI үчүн 0.862, ELISA үчүн 0.854 жана классикалык LFIA үчүн 0.550 болгон. Бирок изилдөө бир гана борбордо жүргүзүлгөн, катышуучулардын баары Түштүк Кореядан болгон жана бул иш чыныгы турмуштагы калкты скринингдөөгө негизделген көз карандысыз клиникалык валидация изилдөөсү эмес.

SELFIнин негизги жаңылыгы CA19-9 үчүн жаңы биомаркер табуудан көрө учурдагы CA19-9 сигналын күчтүүрөөк кылып, төмөнүрөөк концентрацияларда окулчу нанозонд архитектурасын иштеп чыгууда турат. Алтын нанобөлүкчөлөрдүн ортосундагы боштук кичирейген сайын электромагниттик талаанын интенсивдүүлүгү өскөн; белгилүү нанометр аралыкта пайда болгон плазмондук hotspot аймактары көрүнүүчү жарыктын өчүүсүн жана натыйжада нитроцеллюлоза мембранасындагы колориметриялык контрастты күчөткөн.

Аналитикалык моделдик тажрыйбаларда SELFI тест сызыгындагы сигнал 15 мүнөттүн айланасында каныккан. Ошол эле изилдөөдө ELISA процедурасы үчүн 285 мүнөт талап кылынган. SELFIде CA19-9 концентрациясы 1 U mL⁻¹ болгондо өлчөнгөн колориметриялык сигналдын интенсивдүүлүгү 24.67, 200 U mL⁻¹ болгондо 73.17 болсо, бир алтын нанобөлүкчөнү колдонгон классикалык LFIAда ошол эле аралыкта сигнал 6.59дан 11.76га өскөн. Изилдөөдө SELFI CA19-9 үчүн гана эмес, моделдик калибрлөө тажрыйбаларында PSA жана ICAM-1 үчүн да классикалык LFIAга караганда күчтүүрөөк аналитикалык сигнал тенденциясын көрсөткөнү билдирилген; бирок бул кошумча тажрыйбалар ошол биомаркерлер менен байланышкан башка оорулардын клиникалык диагнозу тастыкталды дегенди билдирбейт.

Клиникалык жактан эң көңүл бурарлык жыйынтык эрте баскычтагы PDAC тобунда чыккан. Дени сак көзөмөлдөр менен эрте баскычтагы бейтаптар салыштырылганда SELFIнин орточо AUC мааниси 0.862, ELISAныкы 0.854 болгон жана изилдөөнүн кайталанма статистикалык анализинде айырма үчүн P < 0.0001 табылган. Ал эми өнүккөн баскычтагы PDAC менен дени сак көзөмөлдөр салыштырылганда SELFI жана ELISA дээрлик бирдей натыйжа көрсөткөн: AUC маанилери тиешелүүлүгүнө жараша 0.925 жана 0.926 болуп, алардын ортосундагы айырма маанилүү болгон эмес (P = 0.3363). Демек, жыйынтыктар SELFI айрыкча эрте баскычтагы үлгүлөрдө үмүт жараткан ажыратуу жөндөмүн көрсөткөнүн колдойт, бирок ыкма клиникалык скрининг стандартына айланды же көз карандысыз популяцияларда текшерилди дегенди билдирбейт.

Түркия үчүн эмнени билдирет?

Изилдөөдөгү 150 катышуучунун баары Түштүк Кореядан болгон жана үлгүлөр бир гана үчүнчү деңгээлдеги ооруканада чогултулган. Ошондуктан SELFI үчүн билдирилген AUC маанилерин, CA19-9 бөлүштүрүлүштөрүн же келечекте колдонулушу мүмкүн болгон диагностикалык чек маанилерди Түркиядагы бейтап жана дени сак популяцияларга түз өткөрүүгө болбойт. Түркияда колдонууга жарамдуулугун баалоо үчүн жергиликтүү жана көз карандысыз бейтап когортторунда, ар башка клиникалык борборлорду камтыган валидация изилдөөлөрү, тесттин аналитикалык стандартташтырылышы жана алдын ала аныкталган диагностикалык чектердин текшерилиши керек. Бул изилдөө Түркияда күнүмдүк клиникалык колдонуу далилденгенин көрсөтпөйт, бирок тез жана жогорку сигналдуу латералдык агымга негизделген CA19-9 өлчөөсүн изилдөөгө боло турган техникалык платформа сунуштайт.

Изилдөөнүн негизги маселеси эмне?

Изилдөөнүн баштапкы маселеси панкреастын түтүкчөлүк аденокарциномасын эрте баскычта аныктоо кыйын экендигинде. Иш жаңы PDAC биомаркерин табууга эмес, сары сууда колдонулуп жүргөн CA19-9 биомаркерин ылдамыраак жана сезгичирээк өлчөй турган анализ системасын иштеп чыгууга багытталган.

Латералдык агымдык иммуноанализдер кыска анализ убактысы жана жөнөкөй иштөө принциби менен артыкчылыкка ээ, бирок классикалык системаларда колдонулган болжол менен 20 nm болгон жеке алтын нанобөлүкчөлөрдүн түс сигналы максаттуу заттын концентрациясы төмөн болгондо жетишсиз болуп калышы негизги техникалык көйгөйлөрдүн бири. Изилдөөчүлөр бул маселени бир алтын нанобөлүкчөнүн түсүн күчөтүү менен эмес, көп сандаган алтын нанобөлүкчөлөрдү кремний диоксиди өзөгүнүн үстүндө башкарылуучу нанобоштуктар менен бириктирүү аркылуу чечүүгө аракет кылышкан.

SELFI кантип иштейт?

SELFIде колдонулган негизги нанозонд SiO₂@Au@Au түзүмү. Кремний диоксиди нанобөлүкчөсү ташуучу өзөк катары кызмат кылат; анын бетиндеги алтын нанобөлүкчөлөр бири-бирине нанометр масштабында жакындайт. Алтын нанобөлүкчөлөрдүн ортосундагы ушул тар аймактарда локалдашкан беттик плазмон резонансынан улам күчтүү электромагниттик талаалар, башкача айтканда плазмондук hotspot-тор пайда болот.

Изилдөөдөгү механизмдин түшүндүрмөсүнө ылайык, жергиликтүү электр талаасынын күчөшү нанобөлүкчөлөрдүн сиңирүү кесилишин көбөйтөт. Түшкөн жарыктын көбүрөөк бөлүгү сиңгендиктен, ак нитроцеллюлоза мембранасындагы нанозонд карараак жана контрасттуураак көрүнөт. Ошентип бирдей максаттуу концентрацияда классикалык жеке AuNP негизиндеги LFIAга салыштырмалуу жогорураак колориметриялык сигнал алынат.

Тест учурунда CA19-9 нанозонддогу аныктоочу антитело менен тест сызыгындагы кармоочу антителонун ортосунда иммунологиялык түрдө кармалат. Тест сызыгында топтолгон SiO₂@Au@Au нанозонддору күңүрт түстүү сигнал пайда кылат. Бул сигнал сүрөткө тартылгандан кийин ImageJ менен сандык бааланып, калибрлөө ийри сызыктары аркылуу CA19-9 концентрациясына айландырылган.

Нанобоштук эмне үчүн маанилүү?

Изилдөөчүлөр нанозонддун долбоорун алгач үч өлчөмдүү толкундук оптика симуляциялары менен талдашкан. Симуляция моделинде диаметри 168 nm болгон SiO₂ нанобөлүкчөсүнүн бетине 270 AuNP бирдей бөлүштүрүлгөн. Алтын нанобөлүкчөлөрдүн ортосундагы боштук аралыгы G_Au үчүн 10, 8, 6, 4, 2 жана 1 nm учурлары талданган. Көрүнүүчү аймакты камтыган 400–800 nm толкун узундугунда TE-поляризацияланган электромагниттик толкундар колдонулуп, нанотүзүм суу ичинде жайгашкан деп кабыл алынган.

Симуляцияда AuNPлердин ортосундагы боштук азайган сайын беттеги электр талаасы күчөгөн. Айрыкча G_Au 6 nmден төмөн болгондо нанобөлүкчөлөрдүн ортосунда айкын hotspot аймактары пайда болгон. Сиңирүү, чачыратуу жана экстинкция кесилиштери да электр талаасы күчөгөн сайын көбөйгөн.

Изилдөөчүлөр өсүш бир гана алтын нанобөлүкчөлөрдүн диаметри чоңойгондуктан болобу же жокпу деп өзүнчө текшеришкен. Эң чоң AuNP диаметри болгон учурда бириктирилген нанотүзүмдөгү AuNPнин сиңирүү кесилиши кремний диоксиди бетиндеги обочолонгон бир AuNPге салыштырмалуу болжол менен 2.65 эсе жогору болгон. AuNP диаметри туруктуу болгондо боштук аралыгын кыскартуу да hotspot пайда болуусунда күчтүүрөөк өзгөрүү жараткан. Бул жыйынтыктар сигналдын күчөшүн аныктоочу негизги фактор бөлүкчө диаметри гана эмес, бөлүкчөлөрдүн ортосундагы нанобоштук жараткан плазмондук өз ара аракет экенин колдогон.

Нанозонддор кантип даярдалып, текшерилди?

Эксперименттик этапта изилдөөчүлөр диаметри болжол менен 145 nm болгон SiO₂ нанобөлүкчөлөрүн модификацияланган Stöber ыкмасы менен даярдашкан. Кремний диоксиди бети APTES менен аминделген; 3–5 nm диаметри бар алтын nanoseed-дер даярдалып, кремний диоксиди бетине бекитилген жана андан кийин seed-mediated growth ыкмасы менен AuNPлер өстүрүлгөн.

Алтын прекурсору менен аскорбин кислотасын кошуу циклдеринин саны өзгөртүлүп, SiO₂@Au@Au₁, SiO₂@Au@Au₃, SiO₂@Au@Au₅, SiO₂@Au@Au₇, SiO₂@Au@Au₉ жана SiO₂@Au@Au₁₁ түзүмдөрү алынган. Cs-STEM сүрөттөрүнөн аныкталган орточо AuNP-AuNP боштуктары тиешелүүлүгүнө жараша 9.55, 7.63, 5.89, 3.53, 1.33 жана 1.20 nm болгон.

Көрүнүүчү жарыктын экстинкциясы боштук азайган сайын өскөн. Эң өнүккөн SiO₂@Au@Au₁₁ түзүмүндө максималдуу экстинкция 0.426 болуп өлчөнсө, ошол түзүмдөн кремний диоксиди өзөгү алынып салынган жеке AuNPлерде 0.120 жана 3–5 nm алтын nanoseed-дерде 0.031 өлчөнгөн. Изилдөөчүлөр бул салыштырууну нанобоштукка байланышкан локалдашкан беттик плазмон резонансы таасиринин эксперименттик көрсөткүчү катары түшүндүрүшкөн.

SiO₂@Au@Au₁₁ нанозондунун максималдуу көрүнүүчү жарык экстинкциясы изилдөөдө салыштырылган 200 nm AuNPлерден болжол менен 58 эсе, ал эми классикалык LFIAда колдонулган 20 nm AuNPлерден болжол менен 1.439 эсе жогору болгон. Нитроцеллюлоза мембранасындагы колориметриялык сигнал тажрыйбалары да ошол эле багыттагы натыйжаларды берген.

CA19-9 анализи канчалык тез?

SELFI тест сызыгынын түс интенсивдүүлүгү 1, 2, 5, 10, 15, 30 жана 60 мүнөттүк өнүгүү убактарында көзөмөлдөнгөн. Сигнал алгачкы мүнөттөрдө тез өсүп, болжол менен 15 мүнөттөн кийин ImageJ өлчөөлөрүндө каныгууга жакындаган. Ошондуктан изилдөөчүлөр кийинки өлчөөлөрдө 15 мүнөттүк анализ убактысын колдонушкан. Изилдөөдө салыштырылган ELISA процедурасынын жалпы анализ убактысы болсо 285 мүнөт деп көрсөтүлгөн.

0–200 U mL⁻¹ CA19-9 диапазонундагы моделдик тажрыйбаларда SELFI тест сызыгы 5 U mL⁻¹ жогору концентрацияларда көзгө көрүнгөн, ал эми классикалык LFIAда 100 U mL⁻¹ чейин көрүнүктүү тест сызыгы алынган эмес жана 100 U mL⁻¹ болгондо да сигнал алсыз болгон.

Аныктоо чеги кандай болгон?

SELFI үчүн билдирилген CA19-9 аныктоо чеги (limit of detection, LOD) 0.012 U mL⁻¹, коммерциялык ELISA үчүн 0.3 U mL⁻¹ болгон. Изилдөөнүн Results бөлүмүндө классикалык 20 nm AuNP негизиндеги LFIA үчүн LOD 121.477 U mL⁻¹ деп берилген жана SELFIнин LOD мааниси мындан 10.123 эсе төмөн экени белгиленген.

Булак ичиндеги дал келбестик жөнүндө эскертүү: Изилдөөнүн Discussion бөлүмүндө классикалык LFIA үчүн ошол эле LOD мааниси 12.477 U mL⁻¹ деп жазылган. Ал эми Results бөлүмүндө 121.477 U mL⁻¹ мааниси келтирилип, билдирилген 10.123 эселик айырма 121.477 U mL⁻¹ маанисине шайкеш келет. Ошондуктан булактагы эки башка сан бул жерде унчукпай бир мааниге бириктирилген жок.

Клиникалык сары суу үлгүлөрү эмнени көрсөттү?

Клиникалык баалоодо жалпы 150 сары суу үлгүсү колдонулган: 50 дени сак көзөмөл, 40 эрте баскычтагы/резектабелдүү PDAC жана 60 өнүккөн баскычтагы/локалдык өнүккөн же метастаздык PDAC. CA19-9 деңгээлдери SELFI, классикалык LFIA жана ELISA менен бааланган.

ROC анализинде ар бир топтогу үлгүлөрдүн %90ы кокус тандалып, бул процесс 100 жолу кайталанган. Ошентип бир гана бөлүүгө көз каранды жыйынтыктын ордуна 100 ROC ийри сызыгы жана 100 AUC мааниси түзүлгөн.

Эрте баскычтагы PDAC менен дени сак көзөмөлдөр салыштырылганда SELFIнин орточо AUC мааниси 0.862 (%95 CI: 0.841–0.888), ELISAныкы 0.854 (%95 CI: 0.834–0.881) жана классикалык LFIAныкы 0.550 (%95 CI: 0.528–0.556) болгон. SELFI менен ELISAнын AUC бөлүштүрүлүштөрүн салыштырууда P < 0.0001 билдирилген.

Өнүккөн баскычтагы PDAC менен дени сак көзөмөлдөрдө SELFI AUC 0.925 (%95 CI: 0.914–0.949), ELISA 0.926 (%95 CI: 0.917–0.940) жана LFIA 0.692 (%95 CI: 0.676–0.713) болгон. Бул учурда SELFI менен ELISAнын айырмасы маанилүү эмес болгон (P = 0.3363).

Бардык 150 үлгү чогуу бааланганда SELFI үчүн AUC 0.899 (%95 CI: 0.884–0.919), ELISA үчүн 0.896 (%95 CI: 0.885–0.913) жана LFIA үчүн 0.634 (%95 CI: 0.619–0.647) табылган. SELFI менен ELISA салыштыруусу үчүн P = 0.0142 билдирилген.

Булак ичиндеги экинчи дал келбестик: Discussion бөлүмүндө жалпы үлгүлөр талкууланганда “0.896 vs. 0.899” тартиби сүйлөмдө SELFI ELISAдан жогору деген мазмун менен тескери көрүнөт. Таблица 1 жана Сүрөт 4тө ELISA = 0.896 жана SELFI = 0.899 деп так берилгендиктен, бул жерде таблица жана сүрөт маанилери сакталды, Discussion бөлүмүндөгү тартип катасы өзүнчө белгиленди.

Сүрөттөр эмнени түшүндүрөт?

Сүрөт 1 PDAC клеткаларынан сары суудагы CA19-9 өлчөөсүнө чейинки биологиялык контекстти, SiO₂@Au@Au нанозонддорундагы нанобоштуктарды, SELFI тест тилкесинин иштөө логикасын жана ELISA менен анализ убактысынын салыштыруусун бирге көрсөтөт. Ошол эле сүрөт плазмондук hotspot күчөгөн сайын тест сигналы да өсөт деген негизги долбоордук гипотезаны визуалдаштырат.

Сүрөт 2 сандык электромагниттик симуляция менен эксперименттик нанотүзүм мүнөздөмөсүн байланыштырат. Симуляцияда боштук азайган сайын hotspot интенсивдүүлүгү көбөйөт, ал эми Cs-STEM сүрөттөрүндө эксперименттик даярдалган SiO₂@Au@Au сериясынын боштуктары 9.55 nmден 1.20 nmге чейин кыскартылганы көрүнөт. Экстинкция спектрлери жана мембранадагы сигнал өлчөөлөрү бул морфологиялык өзгөрүү оптикалык натыйжага чагылдырылганын көрсөтөт.

Сүрөт 3 SELFIнин болжол менен 15 мүнөттө сигнал каныгуусуна жетишин, CA19-9 концентрациясына карата SELFI жана LFIA сигнал ийри сызыктарын жана CA19-9, PSA менен ICAM-1 калибрлөө жыйынтыктарын көрсөтөт. Сүрөттөгү анализ убактысы–LOD салыштыруусу SELFIнин изилдөөдө бааланган системалар арасында тез анализ менен төмөн аныктоо чегин бир платформада айкалыштырууну максат кылганын көрсөтөт.

Сүрөт 4 болсо 150 клиникалык сары суу үлгүсүнүн %90дык кайра тандоолору менен түзүлгөн ROC анализин көрсөтөт. Эрте баскычтагы топто SELFI ийри сызыгы ELISAдан бир аз жогору, классикалык LFIAдан кыйла жогору. Өнүккөн баскычтагы топто SELFI жана ELISA ийри сызыктары бири-бирине абдан жакын.

Изилдөө колдогон жыйынтыктар

• SiO₂@Au@Au нанотүзүмдөрүндөгү кичине AuNP-AuNP боштуктар плазмондук hotspot пайда болушу жана күчтүү оптикалык экстинкция менен байланыштуу.
• SiO₂@Au@Au₁₁ нанозонддору классикалык жеке AuNPлерге караганда күчтүүрөөк колориметриялык сигнал жараткан.
• SELFI изилдөөнүн эксперименттик шарттарында CA19-9 өлчөөсүн болжол менен 15 мүнөттө аткарган.
• SELFI үчүн билдирилген CA19-9 LOD мааниси 0.012 U mL⁻¹.
• Изилдөөдөгү Түштүк Корея сары суу когортунда SELFI эрте баскычтагы PDAC менен дени сак көзөмөлдөрдү ажыратууда AUC 0.862 көрсөткөн.
• Классикалык 20 nm AuNP-LFIAнын клиникалык ажыратуу көрсөткүчү SELFI жана ELISAга караганда төмөн болгон.
• PSA жана ICAM-1 моделдик калибрлөөлөрүндө да SELFI классикалык LFIAга караганда жогорураак аналитикалык сигнал тенденциясын көрсөткөнү билдирилген.

Изилдөө колдобогон же азырынча далилдебеген жыйынтыктар

• SELFI жалпы калкта панкреас рагын скринингдөөгө даяр экени көрсөтүлгөн эмес.
• Көз карандысыз көп борборлуу же эл аралык клиникалык валидация жүргүзүлгөн эмес.
• Түрк популяциясында диагностикалык көрсөткүчтөр бааланган эмес.
• SELFI үчүн клиникалык колдонууга өткөрүүгө ылайыктуу акыркы жана көз карандысыз текшерилген диагностикалык cutoff түзүлгөн эмес.
• Тест эрте диагноз аркылуу жашап калууну же дарылоонун натыйжасын жакшыртат деп көрсөтүлгөн эмес.
• CA19-9дун биологиялык чектөөлөрү жоюлган эмес; изилдөөчүлөр Lewis-терс учурлардагы мүмкүн болгон жаңылыш классификацияны келечекте кошумча биомаркерлер менен азайтууну пландашууда.
• PSA жана ICAM-1 моделдик тажрыйбалары SELFIнин бул биомаркерлерге байланышкан оорулардагы клиникалык диагностикалык көрсөткүчүн далилдебейт.
• Азыркы жыйынтыктар ар башка этникалык, географиялык жана клиникалык популяцияларга түз жалпыланбайт.

Изилдөөнүн Методу жана Жыйынтыктары

Изилдөө дизайны жана клиникалык үлгү

Адамдын сары суу үлгүлөрүн колдонууга Seoul National University Bundang Hospital Human Bioresource Center тарабынан этикалык уруксат берилген. Институционалдык этикалык кеңештин номери X-2011-651-903 деп билдирилип, бардык катышуучулардан үлгүлөрүн илимий изилдөө жана жарыялоо максатында колдонууга жазуу жүзүндөгү маалымдалган макулдук алынган. Бейтаптардын маалыматтары анализге чейин анонимдештирилип, жеке идентификациядан ажыратылган.

Дени сак көзөмөлдөр жашы жана жынысы боюнча рак топторуна propensity matching ыкмасы менен дал келтирилип, бул өзгөрмөлөр боюнча топтордун ортосунда статистикалык маанилүү айырма билдирилген эмес. Бардык катышуучулар Ыраакы Чыгыш азиялыктар жана Түштүк Кореялыктар болгон. Шишиктин жайгашуусу эрте жана өнүккөн топтордун ортосунда олуттуу айырмаланган эмес; панкреастын баш бөлүгүндөгү шишиктер учурлардын болжол менен %46сын түзгөн. Медианалык шишик өлчөмү резектабелдүү топто 2.2 cm, өнүккөн топто 3.8 cm болгон.

Изилдөөнүн үлгү көлөмү алдын ала статистикалык күч эсептөөсү менен аныкталган эмес; жеткиликтүү клиникалык үлгүлөргө жараша түзүлгөн. Чогултулган клиникалык үлгүлөрдүн баары анализге киргизилген. Тажрыйбалар рандомизацияланган эмес жана изилдөөчүлөр топтук бөлүштүрүүгө же жыйынтык баалоосуна карата сокур болгон эмес. Кийин post-hoc күч анализи жүргүзүлгөн.

Сандык нанотүзүм симуляциясы

Оптикалык симуляциялар COMSOL Multiphysics 5.4 менен жүргүзүлгөн. 400–800 nm толкун узундугунда TE-поляризацияланган электромагниттик толкун берилген. Алтындын толкун узундугуна көз каранды сынуу көрсөткүчү үчүн изилдөөдө көрсөтүлгөн Werner маалымат базасы колдонулган. Фон талаасын моделдөөдө x жана y багыттарында периоддук чек шарттары жана z багытында порттор, чачыраган талааны моделдөөдө x, y жана z багыттарында perfectly matched layer шарттары колдонулган.

Моделде диаметри 168 nm болгон SiO₂ сферасынын үстүндө 270 AuNP болгон. G_Au боштук аралыктары 10, 8, 6, 4, 2 жана 1 nm болуп өзгөртүлгөн. Кремний диоксиди өзөгүнүн диаметри жана AuNP саны туруктуу болгондуктан, боштук азайган сайын AuNP диаметри чоңойгон.

SiO2@Au@Au нанозондун даярдоо

Диаметри болжол менен 145 nm болгон SiO₂ нанобөлүкчөлөрү модификацияланган Stöber ыкмасы менен даярдалган. Кремний диоксиди бети APTES менен аминделген. 3–5 nm Au nanoseed-дер NaBH₄ колдонуу менен даярдалып, SiO₂-NH₂ бетине бекитилген.

SiO₂@Au түзүмдөрүнүн үстүнө AuNP өстүрүү үчүн 0.2 mg SiO₂@Au 9.8 mL %2 PVP эритмесине кошулган. Аралаштырып турганда ар беш мүнөт сайын 20 μL 10 mM HAuCl₄ жана 40 μL 10 mM аскорбин кислотасы кошулган. Инъекция циклдеринин саны 1, 3, 5, 7, 9 же 11 болуп өзгөртүлүп, ар башка нанобоштуктуу түзүмдөр алынган.

Антитело конъюгациясы жана тест тилкеси

SiO₂@Au@Au₁₁ нанозонддорунун бетине алгач 11-mercaptoundecanoic acid (11-MUA) менен карбоксил кислотасы тобу кошулган. Карбоксил топтору EDC жана sulfo-NHS менен активдештирилип, CA19-9 моноклоналдык аныктоочу антителосу A46400 нанозондго байланыштырылган.

SELFI жана классикалык LFIA тилкелеринде нитроцеллюлоза мембранасындагы көзөмөл сызыгына 1 mg mL⁻¹ goat anti-mouse IgG, тест сызыгына 1 mg mL⁻¹ anti-CA19-9 кармоочу антитело берилген. Тест жана көзөмөл сызыктарынын аралыгы 4.0 mm, таратуу агымы 1.9 μL cm⁻¹ болгон. Мембраналар кеминде эки саат кургатылып, тилкелер 4 mm тууралыкта кесилген.

SELFI моделдик анализи

Моделдик CA19-9 тестинде өнүктүрүү аралашмасы 3 μL CA19-9 үлгүсү, 5 μL SiO₂@Au@Au₁₁ нанозонд суспензиясы жана 25 μL %0.5 PBST болуп, жалпы көлөм 33 μL түзгөн. Тилке 15 мүнөт өнүктүрүлүп, тест сызыгы сүрөткө тартылгандан кийин түс интенсивдүүлүгү ImageJ менен өлчөнгөн.

Калибрлөө үчүн 0, 0.0037, 0.037, 0.37, 3.7, 37, 370, 3700 жана 37000 U mL⁻¹ CA19-9 стандарттары колдонулган. Ушундай эле процесс PSA жана ICAM-1 үчүн да максатка ылайык стандарттар жана антителолор менен кайталанган.

SELFI жана LFIA калибрлөө теңдемелери

SELFI үчүн CA19-9 калибрлөө ийри сызыгы изилдөөдө төмөнкү sigmoid функциясы менен берилген:

\[ \mathrm{Signal\ intensity} = 83.84+ \frac{14.75-83.84} {1+\left(\frac{\mathrm{Concentration}}{20.62}\right)^{0.85}} \]

Жеке AuNP негизиндеги классикалык LFIA үчүн:

\[ \mathrm{Signal\ intensity} = 31.13+ \frac{6.45-31.13} {1+\left(\frac{\mathrm{Concentration}}{689.82}\right)^{1.26}} \]

Изилдөөдө колдонулган жалпы sigmoid калибрлөө модели:

\[ \mathrm{Signal\ intensity} = A_2+ \frac{A_1-A_2} {1+\left(\frac{\mathrm{Concentration}}{X_0}\right)^p} \]

Бул жерде \(X_0\), \(A_1\), \(A_2\) жана \(p\) изилдөөнүн sigmoid калибрлөө ийри сызыгынын параметрлери. Концентрацияны сигнал интенсивдүүлүгүнөн эсептөө үчүн теңдеме төмөнкү түргө келтирилген:

\[ \mathrm{Concentration} = X_0 \times \left( \frac{A_1-\mathrm{Signal\ intensity}} {\mathrm{Signal\ intensity}-A_2} \right)^{1/p} \]

Аныктоо чегине туура келген сигнал:

\[ I_{\mathrm{LOD}} = I_{\mathrm{Blank}} + 3\sigma_{\mathrm{Blank}} \]

түрүндө эсептелген. Бул жерде \(I_{\mathrm{Blank}}\) бош үлгүнүн сигнал интенсивдүүлүгүн, \(\sigma_{\mathrm{Blank}}\) бош үлгү сигналынын стандарттык четтөөсүн билдирет. Алынган \(I_{\mathrm{LOD}}\) мааниси тескери калибрлөө теңдемесине коюлуп, биомаркер концентрациясы боюнча LOD эсептелген.

Клиникалык сары суу анализи

Сары суу үлгүлөрү SELFI жана LFIA анализинин алдында %0.5 PBST менен 10 эсе суюлтулган. Ар бир үлгүдөн 3 μL колдонулуп, кийинки процесс моделдик тесттегидей аткарылган. CA19-9 концентрациясы тест сызыгынын сигнал интенсивдүүлүгү жана калибрлөө ийри сызыгы аркылуу эсептелген.

ELISA өлчөөлөрү өндүрүүчүнүн протоколуна ылайык жүргүзүлгөн. Сары суу үлгүлөрү эки кайталоодо өлчөнгөн; төрт эсе суюлтуудан баштап 200 эсе суюлтулган үлгүлөргө чейин колдонулуп, концентрациялар төрт параметрлүү логистикалык регрессия ийри сызыгы аркылуу эсептелген.

Статистикалык анализ

ROC жана AUC эсептөөлөрү изилдөөчүлөр даярдаган R коду жана pROC китепканасы менен жүргүзүлгөн. Жалпы 150 үлгүнүн ар бир тобунан %10у кокус сыртта калтырылып, баштапкы үлгүлөрдүн %90ы, башкача айтканда 135 үлгү анализденген. Бул процессте болжол менен 45 дени сак көзөмөл, 36 эрте баскычтагы PDAC жана 54 өнүккөн баскычтагы PDAC үлгүсү колдонулган.

Кокус субүлгүлөө туруктуу random seed менен 100 жолу кайталанган. Натыйжада 100 ROC ийри сызыгы жана 100 AUC мааниси алынган. SELFI жана ELISA үчүн орточо ROC ийри сызыктары сызыктуу интерполяция менен эсептелген; LFIA ийри сызыгы байкалган минималдуу жана максималдуу сигнал маанилеринен алынган дискреттик чечим чектери менен түзүлгөн. Орточо AUC жана %95 ишеним интервалдары 100 кайталоодон эсептелген.

AUC бөлүштүрүлүштөрүн салыштырууда эки тараптуу Student's t-test колдонулган. Эрте баскычтагы PDAC + дени сак көзөмөл салыштыруусунда ELISA–SELFI үчүн P < 0.0001, бардык PDAC үлгүлөрүн баалоодо P = 0.0142 жана өнүккөн баскычтагы PDAC + дени сак көзөмөл салыштыруусунда P = 0.3363 билдирилген. Классикалык LFIA менен SELFIнин бардык салыштырууларында P < 0.0001 табылган.

Изилдөөнүн негизги методологиялык чектөөлөрү

• Үлгү көлөмү алдын ала күч анализинин негизинде аныкталган эмес; клиникалык үлгүлөрдүн жеткиликтүүлүгү негиз болгон.
• Изилдөө бир борборлуу.
• 150 катышуучунун баары Түштүк Кореялыктар.
• Тажрыйбалар рандомизацияланган эмес.
• Изилдөөчүлөр тажрыйба топторуна жана жыйынтык баалоосуна карата сокур болгон эмес.
• Жыныска өзгөчө диагностикалык субанализ үчүн изилдөөнүн күчү жетишсиз болгон жана мындай анализ жүргүзүлгөн эмес.
• Учурдагы маалымат үчүн post-hoc күч анализи жүргүзүлгөнү менен, ал алдын ала пландалган үлгү көлөмүн эсептөөнүн ордун баспайт.
• SELFI үчүн көз карандысыз тышкы когортто алдын ала аныкталган клиникалык cutoff валидациясы жүргүзүлгөн эмес.
• Изилдөөчүлөр кеңири этникалык жана географиялык когортторду, стандарттык сигнал анализин, оптималдуу cutoff аныктоону жана Lewis-терс учурлар үчүн кошумча биомаркерлерди келечектеги иштер катары көрсөтүшкөн.

Булак жана Ыкма Жөнүндө Эскертүү

Авторлор

Sohyeon Jang, Minsup Shin, Jiseok Han, Han-Joo Bae, Yuna Youn, Hye-Seong Cho, Kwanghee Yoo, Jun-Sik Chu, Jaehyun An, Geunhyeong An, Hyejin Chang, Jin-Hyeok Hwang, Jaehi Kim, Jihwan Song, Jong-chan Lee, Luke P. Lee жана Bong-Hyun Jun.

Тең салым: Sohyeon Jang, Minsup Shin жана Jiseok Han изилдөөгө тең салым кошкон.

Жооптуу авторлор: Jaehi Kim, Jihwan Song, Jong-chan Lee, Luke P. Lee жана Bong-Hyun Jun.

Мекемелер

1. Department of Bioscience and Biotechnology, Konkuk University, Seoul, Republic of Korea.
2. Department of Mechanical Engineering, Hanbat National University, Daejeon, Republic of Korea.
3. Department of Internal Medicine, Seoul National University Bundang Hospital, Seongnam, Republic of Korea.
4. Company of BioSquare, Hwaseong, Republic of Korea.
5. Division of Science Education, Kangwon National University, Chuncheon, Republic of Korea.
6. College of Medicine, Seoul National University, Seoul, Republic of Korea.
7. Harvard Medical School; Department of Medicine, Brigham and Women’s Hospital, Boston, Massachusetts, USA.
8. Department of Bioengineering, University of California, Berkeley, California, USA.
9. Department of Electrical Engineering and Computer Science, University of California, Berkeley, California, USA.
10. Korea Biomedical Institute for Global Health Research and Technology (K-BIGHEART), Pohang University of Science and Technology (POSTECH), Pohang, Republic of Korea.

Каржылоо

Булакта изилдөө Republic of Korea Ministry of Science and ICT колдогон NRF-2022R1A2C2012883, Bio & Medical Technology Development Program алкагындагы 2021M3C1C3097211 жана Korean government (MSIT) каржылаган National Research Foundation of Korea колдоосу RS-2023-00222910 менен байланышкан. Изилдөө популяциясы бөлүмүндө ошондой эле BRIDGE Convergence R&D программасынын “Development of Early Detection Technology for Pancreatic Cancer via Liquid Biopsy Using Fiber Optic-Based Raman Spectroscopy and Artificial Intelligence System” долбоору жана NRF-2021M3C1C3097204 долбоор номери көрсөтүлгөн.

Маалымат жана коддун жеткиликтүүлүгү

Иштетилген сандык маалыматтар, тест жыйынтыктары жана ROC/статистикалык анализде колдонулган маалыматтар изилдөөнүн кошумча таблицалары жана source data файлдары менен берилген. Адамдын сары суу үлгүлөрүнө тиешелүү жеке клиникалык маалыматтар этикалык жана укуктук купуялуулук чектөөлөрүнө байланыштуу ачык эмес жана Seoul National University Bundang Hospital Human Bioresource Center ичинде көзөмөлдөнгөн жеткиликтүүлүктө сакталат.

Изилдөөдө колдонулган код GitHubдагы JKim-45/SELFI репозиторийинде бар экени жана Zenodoдо 10.5281/zenodo.17958691 DOI менен архивделгени билдирилген.

Авторлордун салымы

S.J., M.S., J.K. жана B.-H.J. тажрыйбаларды долбоорлогон. S.J., M.S., J.H., H.-J.B., Y.Y., H.-S.C., K.Y., J.-S.C., J.A., G.A. жана J.K. тажрыйбаларды жана анализдерди аткарган. J.K. статистикалык анализ үчүн атайын R коддорун иштеп чыккан. S.J., M.S., J.H., Y.Y., J.K., J.-C.L. жана B.-H.J. макаланы жазган. S.J., M.S., J.H., H.C., J.-H.H., J.K., J.S., J.-C.L., L.P.L. жана B.-H.J. текстти кайра карап чыгууга катышкан. L.P.L. жана B.-H.J. жалпы процессти көзөмөлдөгөн. Булакта бардык авторлор акыркы версияны бекиткени айтылат.

Кызыкчылыктардын кагылышы

Авторлор кызыкчылыктардын кагылышы жок экенин билдирген.

Лицензия жана визуалдык материалды колдонуу жөнүндө эскертүү

Макала CC BY-NC-ND 4.0 лицензиясы менен жарыяланган. Лицензия туунду же ыңгайлаштырылган материалды бөлүшүүгө жол бербегендиктен, булак макаладагы түпнуска Сүрөт 1–4 бул Verianla мазмунунда көчүрүлгөн эмес, кыргызча кайра чийилген эмес жана адаптацияланган визуал катары колдонулган эмес. Макаладагы Verianla Live компоненти изилдөө жарыялаган сандык AUC маанилерин гана көз карандысыз HTML маалымат таблицасында көрсөтөт.

Булак ичиндеги дал келбестик жөнүндө эскертүү

Булакта классикалык жеке AuNP-LFIAнын CA19-9 LOD мааниси Results бөлүмүндө 121.477 U mL⁻¹, Discussion бөлүмүндө болсо 12.477 U mL⁻¹ деп жазылган. Ошол эле жерде билдирилген 10.123 эселик SELFI/LFIA LOD айырмасы 121.477 U mL⁻¹ маанисине туура келет; ошентсе да булактагы 12.477 мааниси унчукпай өчүрүлгөн жок жана дал келбестик ачык белгиленди.

Discussion бөлүмүндөгү жалпы үлгү AUC баянында да 0.896 жана 0.899 маанилеринин тартиби сүйлөмдүн субъектисине шайкеш эмес көрүнөт. Таблица 1 жана Сүрөт 4 ELISA үчүн 0.896 жана SELFI үчүн 0.899 маанилерин ачык берет. Verianla макаласындагы салыштырма таблица ушул түз таблица/сүрөт маанилерин негиз кылып, булак ичиндеги баяндоо дал келбестигин өзүнчө көрсөтөт.

Илимий чечмелөөнүн чеги

Бул изилдөө нанобиосенсор жана диагностикалык assay иштеп чыгуу эмгеги болуп, клиникалык сары суу үлгүлөрү менен баштапкы деңгээлдеги диагностикалык көрсөткүчтү баалоону камтыйт. Жыйынтыктар SELFI азыркы когортто CA19-9ду тез жана төмөн аналитикалык аныктоо чеги менен өлчөй аларын, айрыкча эрте баскычтагы PDAC/дени сак көзөмөл салыштыруусунда күчтүү AUC көрсөткөнүн колдойт. Бирок изилдөө бир борборлуу жана бир географиялык/этникалык популяцияга негизделген; рандомизация же сокурлоо колдонулган эмес, үлгү көлөмү алдын ала күч анализи менен аныкталган эмес жана көз карандысыз тышкы валидация жүргүзүлгөн эмес. Ошондуктан бул изилдөө SELFI күнүмдүк клиникалык скрининг же диагноз стандарты болуп калды деген жыйынтыкты колдобойт.

Бул Verianla мазмунунун илимий баяны жүктөлгөн изилдөөнүн ыкма, жыйынтык, таблица, сүрөт жана талкуу бөлүмдөрүнө негизделет. Тышкы булактар изилдөөнүн актуалдуу библиографиялык жарыя абалын гана текшерүү үчүн колдонулган; негизги илимий баяндамага сырттан жаңы эксперименттик натыйжа, клиникалык маалымат же механизм кошулган эмес.