Bu tədqiqat, burun yolu ilə vərilən lipopolisakkarid (LPS) və Bacillus subtilis endosporlarının (BSS) IgE aracılı anafilaksi reaksiyasıni erkək siçanlarde azaltıp azaltmadığını və bu etkinin hangi hüceyrəsel mexanizmyla ortaya çıktığını incelemiştir. Altı ila on haftalık siçanlara iki gün boyunca burun üçündən LPS və ya BSS uygulanmış; ardından pasif sistemik ya da pasif kutanöz anafilaksi oluşturulmuştur. LPS’nin 4 µg/kg və BSS’nin 1 × 10⁷ CFU/fare dozu; bədən temperaturundaki düşüş, plazma mast hüceyrəsi proteazı-1 düzeyi, Evans mavisi damar xaricinə sızması və qulaq ödemi gibi ölçütleri azaltmışdır. Grafiklerdeki etki böyüklüğü, ağızdan vərilən 2 mg/kg deksametazon grubuna yakın görünmüştür. Lakin tədqiqat resmî bir ekvivalentlik və ya üstünlük təcrübəi kimi tasarlanmamıştır.

Genetik və farmakolojik təcrübələr, qoruyucu təsirnin tip I interferon reseptoru IFNAR’a bağlı olduğunu göstərmişdir. IFNAR1 bulunmayan siçanlarda LPS və BSS anafilaksi belirtilərini azaltmamıştır. Araştırmacılar LPS və BSS’nin IFN-α/β üretimini tetiklediğini; bunun mast hüceyrələrinde Cyp51a1 və Hmgcr genlerinin ifadesini düşürdüğünü, mevalonat yolundaki sterol dışı izoprenoidleri azalttığını və FcεRI siqnalının ilərlemesi üçün gereken kortikal F-aktin yeniden düzenlenmesini bozduğunu iləri sürmektedir.

Mekanizma bütünüyle birbaşa ölçülməmişdir. Tədqiqatda IFN-α/β zülal düzeyleri, lanosterol miktarı, hüceyrə içi izoprenoid havuzu, zülal prenilasyonu, HMGCR zülal miktarı, kortikal F-aktinin canlı hüceyrə dinamiği və ya kalsiyum akışı birbaşa ölçülməmişdir. Mekanik zincir; gen ifadəsi, IFNAR eksikliği, terbinafin tətbiqsı, mevalonat yolu ara ürünleri, histologiya və sitokalazin D ilə konstruksiyalan geri çevirme təcrübələrinin birlikdə yorumlanmasına dayanmaktadır.

BSS, LPS’ye göre daha aşağı Il-6 və Il-1β transkripsiyonu oluştururken daha belirgin Ifn-α4 və Ifn-β1 yanıtı üretmiştir. Bu bulgu BSS üçün daha elvərişli bir sitokin profiline işaret etse de insanlarda təhlükəsizlik kanıtı değildir. Tədqiqatda uzun dönem toksisite, təkrarlanan burun içi tətbiq, sporların dokulardaki dağılımı, çimlenme riski, immünojenisite, mikrobiyom etkisi və ya klinik anafilaksi tedavisi dəyərlendirilmemiştir.

Tədqiqatın əsas sualı nədir?

Araştırmanın temel sorusu, mikrobiyal çevreden solunum yoluyla alınabiləcek iki fərqlı uyarıcının mast hüceyrələrini sistemik kimi daha az tepkili hâle getirip getiremeyeceğidir. Araştırmacılar Gram-negatif bakterilərin bir komponenti olan lipopolisakkaridi və Gram-pozitif Bacillus subtilis bakterisinin dayanıklı endosporlarını iki ayrı mikrobiyal maruziyet modeli kimi kullanmıştır.

Tədqiqatnın çıkış noktası, çiftlik ortamlarında büyüyen çocuklarda bazı alerjik hastalıkların daha aşağı görülmesiyle ilişkiləndirilən “çiftlik etkisi”dir. Bununla belə tədqiqat gerçek bir çiftlik ortamını, çocukları və ya doğal çevresel maruziyeti incelememiştir. LPS və belirli bir B. subtilis suşundan laboratoriyada üretilən endosporlar kontrollü fare təcrübələrinde tətbiq edilmişdir. Bu nedenle nəticələr çiftlik ortamındaki bütün mikrobiyal çbərabərliliğin etkisini temsil etmez.

Anafilakside mast hüceyrələri neden əhəmiyyətlidir?

Mast hüceyrələri, yüzeylerinde yüksək afiniteli IgE reseptörü FcεRI taşıyan bağışıklık hüceyrələridir. IgE’ye bağlanan bir antijen, FcεRI moleküllerini çapraz bağladığında hüceyrə üçünde çok aşamalı bir sinyal ağı başlar. Bu ağ kalsiyum girişini, hüceyrə iskeleti değişikliklerini və granüllerin hüceyrə zarına taşınmasını sağlar.

Degranülasyon adı vərilən müddətçte histamin, proteazlar və başka bioloji aracı maddeler hüceyrə dışına salınır. Bu maddeler damar geçirgenliğinin artmasına, doku ödemine, kan basıncı değişikliklerine və sistemik reaksiyonlarda bədən temperaturunın düşmesine katkıda bulunabilir. Tədqiqat, LPS və BSS’nin aracı maddeler salındıktan sonra damarları birbaşa duyarsızlaştırmasından ziyade mast hüceyrəsinin degranülasyon aşamasını baskıladığı hipotezini sınamıştır.

Pasif anafilaksi modeli ne anlama gelmektedir?

Tədqiqatda heyvanların doğal kimi bir alerjene duyarlı hâle gelmesi beklenmemiştir. Farelere əvvəl dinitrofenole özgü IgE antikoru vərilmiş, daha sonra DNP ilə bağlanmış sığır serum albümini kullanılarak reaksiyon tetiklenmiştir. Bu üsul “pasif” anafilaksi kimi adlandırılır; çünki alerjene özgü IgE bağışıklık sistemi tarafından zaman üçünde üretilmek yerine dışarıdan vərilmektedir.

Bu model mast hüceyrəsi–IgE eksenini kontrollü biçimde incelemeyi kolaylaştırır. Buna qarşılık doğal gıda alerjisi, astım, atopik dermatit və ya insan anafilaksisinin oluşumunda yer alan duyarlanma, T və B hüceyrəsi yanıtları, mukozal bariyerler, mikrobiyom və fərqlı alerjenler modelde bütünüyle temsil edilmez.

Bacillus subtilis endosporları nasıl hazırlanmıştır?

Araştırmacılar Bacillus subtilis KCTC 1021 suşunu kullanmıştır. Tek bir bakteri kolonisi 5 mL Luria–Bertani besiyerine aktarılmış və 37 °C’de, dakikada 200 devir çalkalama altında gece boyunca çoğaltılmıştır. Kültür ertesi gün taze besiyerinde 1:100 nisbətinda seyreltilmiş və 600 nm’de optik yoğunluk 0,6–0,8 düzeyine ulaşıncaya kadar büyütülmüştür.

Spor oluşumunu başlatmak üçün bakterilər; besin suyu, KCl və MgSO₄·7H₂O içeren sporülasyon ortamına aktarılmıştır. Sterilizasyon sonrasında ortama 1 mM Ca(NO₃)₂, 10 µM MnCl₂ və 1 µM FeSO₄ eklenmiştir. Kültürler 37 °C’de və 200 rpm’de 24–48 saat tutulmuştur.

Faz kontrast mikroskopisinde olgun sporlar parlak və ışığı kıran konstruksiyalar, vəjetatif bakterilər ise koyu hüceyrəler kimi dəyərlendirilmiştir. Sporülasyon nisbəti %90’ı aştığında kültürler 4 °C’de 4.000 × g kuvvətinde 15 dakika santrifüjlenmiştir. Hücre çökeltisi üç kez steril suyla yıkanmış, kalan vəjetatif hüceyrələri uzaklaştırmak üçün 65 °C’de 30 dakika ısıtılmış və iki kez daha yıkanmıştır.

Spor miktarı seri seyreltme və koloni oluşturan birim sayımıyla belirlenmiştir. CFU, “koloni oluşturan birim” anlamına gelir və uygun besiyerinde koloni oluşturabilən canlı birimlerin tahmini sayısını ifade eder. Hazırlanan sporlar steril PBS və ya su üçünde 4 °C’de saklanmıştır.

Sistemik anafilaksi təcrübəi nasıl yürütülmüştür?

Farelere iki gün boyunca günde bir kez burun üçündən PBS, LPS və ya BSS vərilmiştir. Pozitif qarşılaştırma grubuna deksametazon ağızdan tətbiq edilmişdir. İkinci tətbiq gününde siçanlara damar yoluyla 3 µg anti-DNP IgE vərilmiştir. Bir sonraki gün 80 µg DNP-BSA damar yoluyla uygulanarak sistemik anafilaksi tetiklenmiştir.

Antijen tətbiqsından 30 dakika sonra rektal sıcaklık ölçülmüş, bir saat sonra kan alınarak plazma fare mast hüceyrəsi proteazı-1 düzeyi ELISA ilə belirlenmiştir. MCPT-1, mast hüceyrəsi degranülasyonunun sistemik bioloji göstergelerinden biri kimi istifadə edilmişdir.

Deksametazon dozu 2 mg/kg kimi seçilmiştir. Yazarlar bu dozu əvvəlki bir tədqiqatya dayanarak lenfopeniye yol açmayan en yüksək doz şeklinde tanımlamaktadır. Mevcut tədqiqatda lenfosit sayısı həmçinin ölçülməmişdir.

Kutanöz anafilaksi təcrübəi nasıl tətbiq edilmişdir?

Pasif kutanöz anafilaksi modelinde 3 µg anti-DNP IgE birbaşa fare kulağına deri üçünden vərilmiştir. Ertesi gün 80 µg DNP-BSA ilə birlikdə 2,5 mg Evans mavisi damar yoluyla tətbiq edilmişdir.

Evans mavisi kandaki zülallere bağlanır. Damar geçirgenliği arttığında boya damar dışına çıkar və dokuda birikir. Antijen tətbiqsından 60 dakika sonra kulak kalınlığı dijital kumpasla ölçülmüş; kulak dokusundaki boya 500 µL DMSO üçünde gece boyunca çıkarılmış və 620 nm’de absorbans ölçülmüşdür.

Bu təcrübə iki tamamlayıcı nəticə üretmiştir: kulak kalınlığındaki artış ödemi, Evans mavisi sinyali ise damar dışına sıvı və zülal kaçışını göstərmişdir.

LPS və BSS anafilaksi meyarlarıni nasıl değiştirmiştir?

Şəkil 1’in ana mesajı, hem LPS’nin hem de BSS’nin doz yükseldikçe sistemik və kutanöz anafilaksi meyarlarıni azalttığıdır. Tedavi uygulanmayan antijen grubunda rektal sıcaklık yaklaşık 34 °C düzeyine düşerken LPS’nin 4 µg/kg və BSS’nin 10⁷ CFU/fare dozu qrafiklerde sıcaklığı yaklaşık 36 °C çevresinde korumuştur. Bu dəyərler şəkilden yaklaşık okunmaktadır; tədqiqatnın metninde grup ortalamalarının tam ədədi tablosu vərilmemiştir.

Plazma MCPT-1 düzeyi tedavisiz anafilaksi grubunda yaklaşık 10–12 ng/mL iken etkili LPS və BSS dozlarında yaklaşık 4–7 ng/mL aralığına geriləmiştir. Kutanöz modelde Evans mavisi sinyali və kulak kalınlaşması da belirgin biçimde azalmıştır.

LPS üçün 0,4, 4 və 40 µg/kg; BSS üçün 10⁶, 10⁷ və 10⁸ CFU/fare dozlarının gösterildiği qrafikler, etkinin dozla birlikdə arttığını destəklemektedir. Araştırmacılar 4 µg/kg LPS ilə 10⁷ CFU/fare BSS’nin etkisini 2 mg/kg deksametazona benzer kimi yorumlamıştır.

“Benzer etki” ifadesi, qrafiklerdeki böyüklüklerin və anlamlılık nəticələrının qarşılaştırılmasına dayanmaktadır. Tədqiqat formal bir ekvivalentlik, ekvivalent olmama sınırı və ya non-inferiority analizi içermemektedir. Bu nedenle BSS’nin deksametazonla farmakolojik kimi ekvivalent olduğu sonucuna varılamaz.

LPS və BSS aynı sitokin profilini mi oluşturmuştur?

Hayır. Şəkil 2, iki mikrobiyal uyarıcının fərqlı gen ifadəsi profilleri oluşturduğunu göstərir. Araştırmacılar periferik kan mononükleer hüceyrələrinde və akciğerde Ifn-α4, Ifn-β1, Il-6 və Il-1β mRNA düzeylerini incelemiştir.

LPS, özellikle 40 µg/kg dozunda Ifn-β1 ifadesini yükseltmiş; lakin incelenen müddətlerde Ifn-α4 üzerinde sınırlı etki göstərmişdir. Buna qarşılık BSS’nin 10⁷ və 10⁸ CFU/fare dozları hem Ifn-α4 hem de Ifn-β1 transkripsiyonunu dört saat üçünde artırmış, yanıt sekizinci saatte daha belirgin hâle gelmiştir.

Proinflamatuvar sitokinlerde ters bir örüntü görülmüştür. LPS, 4 µg/kg dozunda bilə Il-6 və Il-1β transkripsiyonunu yükseltmiş və 40 µg/kg’da artış daha güçlü olmuştur. BSS ise en yüksək dozda dahi bu iki gen üçün yaklaşık iki katın altında və ya sınırlı artışlar oluşturmuştur.

Akciğer örneklerinde de BSS’nin tip I interferon genlerini, LPS’nin ise proinflamatuvar genleri daha belirgin biçimde uyarmasıyla uyumlu bir dağılım görülmüştür. Bununla belə ölçülenler mRNA düzeyleridir. Tədqiqat kandaki və ya dokudaki IFN-α, IFN-β, IL-6 və IL-1β zülal konsantrasyonlarını raporlamamıştır.

Gen ifadesi nasıl hesaplanmıştır?

RT-qPCR analizleri təknik kimi üçlü çalışılmış və hedef genlerin ifadesi β-aktin mRNA’sına göre normalize edilmiştir. Göreli gen ifadəsi 2^−ΔΔCt üsuliyle hesaplanmıştır:

\[ Göreli\ gen\ ifadesi = 2^{-\Delta\Delta Ct} \]

Bu ilişkide Ct, PCR siqnalının belirlenen eşiği geçtiği döngü sayısıdır. Önce hedef gen ilə β-aktin arasındaki Ct fərqı hesaplanır:

\[ \Delta Ct = Ct_{hedef} - Ct_{\beta\text{-aktin}} \]

Daha sonra tedavi grubunun ΔCt dəyəri kontrol grubunun ΔCt dəyərinden çıkarılır:

\[ \Delta\Delta Ct = \Delta Ct_{tedavi} - \Delta Ct_{kontrol} \]

Sonuç 1 ise kontrol grubuna yakın ifade, 2 ise yaklaşık iki kat ifade, 0,5 ise yaklaşık yarı düzeyde ifade anlamına gelir. Yöntem PCR vərimlerinin hedef və referans genler arasında yeterince benzer olduğu varsayımına dayanır.

Koruyucu etki neden IFNAR sinyaline bağlanmıştır?

Şəkil 3’te IFNAR1 reseptörü eksik siçanlar istifadə edilmişdir. Normal və ya heterozigot Ifnar1^+/− siçanlarda LPS və BSS, Evans mavisi sızıntısını, qulaq ödemini, sıcaklık düşüşünü və MCPT-1 düzeyini azaltmışdır. Homozigot Ifnar1^−/− siçanlarda ise aynı tedavilər anlamlı bir koruma sağlamamıştır.

Deksametazonun etkisi IFNAR1 eksikliğinde korunmuştur. Bu ayrım LPS və BSS’nin deksametazondan fərqlı, IFNAR’a asılı bir mexanizmyla hareket ettiğini destəklemektedir.

Tedavi vərilmemiş IFNAR1 eksik siçanlarda anafilaksi reaksiyasınin kontrol siçanlarinden daha şiddetli olduğu da bildirilmişdir. Araştırmacılar bunu normal, aşağı düzeyli IFNAR siqnalının mast hüceyrəsi olgunlaşması və aktivasyonu üzerinde düzenleyici bir rolü olabiləceği şeklinde yorumlamıştır.

Etki damar hüceyrələrinin birbaşa baskılanmasından kaynaklanabilir mi?

Bu mümkünlığı sınamak üçün mast hüceyrələri atlanarak kulak derisine 1 µg serotonin və 10 µg histamin vərilmiştir. Histamin və serotonin birbaşa damar endoteli üzerinde etkili kimi geçirgenlik və ödem oluşturmuştur.

LPS və ya BSS ön tətbiqsı bu modelde Evans mavisi sızıntısını ya da kulak kalınlaşmasını azaltmamıştır. Dolayısıyla tedavilərin damar endoteline birbaşa genel bir müqavimət kazandırmasından ziyade histamin və diğer aracı maddeler salınmadan əvvəl, mast hüceyrəsi aktivasyonu düzeyinde etkili olduğu sonucuna varılmıştır.

Bu təcrübə mast hüceyrəsi üstündeki etkiyi destəklese de diğer bağışıklık hüceyrələrinin, sinirsel düzenlemenin və ya sistemik metabolik değişikliklerin katkısını bütünüyle dışlamaz.

Mevalonat yolu nedir və mast hüceyrəsiyle nasıl ilişkiləndirilmiştir?

Mevalonat yolu, hüceyrənin kolesterol və çbərabərli izoprenoid ara ürünlerini ürettiği metabolik ağdır. HMG-CoA redüktaz və ya HMGCR, yolun hız sınırlayıcı enzimidir. Enzim, HMG-CoA’yı mevalonata dönüştürür.

Mevalonattan iki ana ürün grubu oluşabilir. Bir kol kolesterol və diğer sterollerin sentezine ilərler. Diğer kol ise izopentenil pirofosfat, farnesil pirofosfat və geranilgeranil pirofosfat gibi sterol dışı izoprenoidleri üretir.

FPP və GGPP, bazı zülallere lipid gruplarının eklenmesi anlamına gelen prenilasyon üçün gereklidir. Prenilasyon, kiçik GTPazlar gibi sinyal zülallerinin hüceyrə zarına bağlanmasını və doğru hüceyrəsel konuma taşınmasını etkiləyebilir. Tədqiqatnın modeli, bu ürünlerin azalmasının mast hüceyrəsindeki aktin yeniden düzenlenmesini və FcεRI siqnalının ilərlemesini aksattığı yönündedir.

Önerilən molekulyar zincir nasıl işlemektedir?

Araştırmacıların önerdiği mexanizm aşağıdaki sıraya sahiptir:

1. LPS və ya BSS, tip I interferon yanıtını başlatır.
2. IFN-α/β, ortak reseptör IFNAR üzerinden sinyal vərir.
3. Mast hüceyrələrinde Cyp51a1 transkripsiyonu azalır.
4. CYP51A1 aktivitesinin azalması səbəbindən lanosterol birikimi oluştuğu düşünülür.
5. Lanosterol, Hmgcr transkripsiyonunu və muhtemelen HMGCR zülal kararlılığını azaltır.
6. Mevalonat üretimi və sterol dışı izoprenoid havuzu azalır.
7. Küçük GTPazlar və diğer biyomoleküller üçün gerekli prenilasyon sınırlanır.
8. Kortikal F-aktinin antijen uyarısına yanıt kimi yeniden düzenlenmesi bozulur.
9. LAT–PLC-γ1 sinyal kompleksinin oluşumu, PLC-γ1 aktivasyonu və dış ortamdan kalsiyum girişi engellenir.
10. Mast hüceyrəsi degranülasyonu və histamin salımı azalır.

Bu zincirin bütün basamakları aynı tədqiqatda birbaşa ölçülməmişdir. Doğrudan ölçülen başlıca unsurlar Cyp51a1 və Hmgcr mRNA düzeyleri, anafilaksi meyarları, mast hüceyrəsi morfolojisi və histamin salımıdır. Lanosterol birikimi, izoprenoid azalması, prenilasyon kaybı və aktin mexanizmsı müdahale təcrübələrinden çıkarılmıştır.

Cyp51a1 və Hmgcr genleri nasıl değişmiştir?

Şəkil 4’te LPS və BSS’nin Ifnar1^+/− siçanlardan alınan peritoneal mast hüceyrələrinde hem Cyp51a1 hem de Hmgcr mRNA düzeylerini yaklaşık yarıya və ya daha altına indirdiği görülmektedir. Ifnar1 mRNA səviyyəsi ise tedavilərden etkilənmemiştir.

IFNAR1 eksik mast hüceyrələrinde LPS və ya BSS bu iki geni baskılamamıştır. Ayrıca eksik siçanlarda başlangıç Cyp51a1 və Hmgcr düzeylerinin kontrol siçanlarinden daha yüksək olması, bazal IFNAR siqnalının bu metabolik genler üzerinde müddətkli bir baskı oluşturabiləceğini düşündürmüştür.

Deksametazon Cyp51a1 və ya Hmgcr ifadesini düşürmemiştir. Bu bulgu, deksametazon ilə mikrobiyal uyarıcıların benzer fenotipik nəticələra fərqlı hüceyrəsel yollar üzerinden ulaşabiləceğini göstərir.

Terbinafin təcrübəi neyi sınamıştır?

Terbinafin, skualen epoksidaz enzimini inhibe eder. Bu enzim, skualenin lanosterol sentezine doğru ilərlemesindeki üst basamaklardan birinde görev yapmaktadır. Araştırmacılar, Cyp51a1 baskılandığında ortaya çıktığı düşünülen lanosterol birikimini önlemek amacıyla LPS və ya BSS ilə birlikdə terbinafin vərmiştir.

Terbinafin, LPS və BSS’nin Cyp51a1 mRNA səviyyəsini düşürmesini engellememiş; lakin Hmgcr ifadesini yeniden kontrol düzeyine yaklaştırmıştır. Bu konumlandırma əhəmiyyətlidir: nəticə, Cyp51a1 baskılanmasının üst basamakta bulunduğunu və Hmgcr baskılanmasının lanosterol oluşumuna bağlı olabiləceğini destəklemektedir.

Şəkil 5’te terbinafinin LPS və BSS’nin kutanöz anafilaksi üzerindeki qoruyucu təsirsini de ortadan kaldırdığı görülmektedir. Evans mavisi sızıntısı və qulaq ödemi yeniden yüksəlmişdir. Bu geri çevirme IFNAR1 eksik siçanlarda görülmemiştir.

Lanosterol tədqiqatda birbaşa kimyəvi üsulle ölçülməmişdir. Terbinafin təcrübəinin sonucu, lanosterolün rolünü destəkleyen dolayı bir farmakolojik kanıttır.

Mevalonat yolu ara ürünleri ne göstərmişdir?

Araştırmacılar LPS və ya BSS ilə birlikdə mevalonolakton, farnesol ya da skualen uygulamıştır. Mevalonolakton hüceyrə üçünde mevalonatla əlaqəli üst bir ara ürün, farnesol sterol dışı izoprenoid ürünlerle bağlantılı bir biləşik, skualen ise kolesterol sentez kolunun lanosterolden əvvəlki ara ürünüdür.

Mevalonolakton və farnesol, LPS və BSS’nin anafilaksi üzerindeki qoruyucu təsirsini ortadan kaldırmıştır. Buna qarşılık skualen qoruyucu təsiryi geri çevirmemiştir.

Bu ayrım, mast hüceyrəsi baskılanmasının kolesterol sentezinin son ürünlerinden ziyade mevalonat yolunun sterol dışı izoprenoid kolundaki azalmayla əlaqəli olduğu yorumunu destəklemektedir. Bununla belə IPP, FPP və ya GGPP’nin hüceyrə içi konsantrasyonları birbaşa ölçülməmişdir.

Histoloji mast hüceyrələrinde ne göstərmişdir?

Şəkil 6’da fare kulağı dokusundaki mast hüceyrələri toluidin mavisiyle boyanmıştır. Antijen uygulanmamış siçanlarda hüceyrəler oval, sınırları belirgin və sitoplazmaları yoğun mor-mavi granüllerle dolu görünmüştür. Bu morfoloji dinlenme durumundaki mast hüceyrəsini temsil etmektedir.

Tedavi vərilmeden antijenle uyarılan siçanlarda hüceyrə sınırlarının bozulduğu, sitoplazmada geniş və açıq alanların ortaya çıktığı və granül boyamasının kaybolduğu görülmüştür. Araştırmacılar bu hüceyrələri yoğun degranülasyon gösteren hüceyrəler kimi sınıflandırmıştır.

LPS, BSS və deksametazon gruplarında açıq alanlar daha kiçik, hüceyrə sınırları daha izlenebilir və granül kaybı daha sınırlıdır. Bazı hüceyrəler uzamış bir şəkil almasına rağmen yoğun degranülasyon görüntüsü daha az görülmüştür.

Hücreler dinlenme, kısmi degranülasyon və yaygın degranülasyon olmak üzere üç gruba ayrılmıştır. Kesit kenarında kalan hüceyrə parçalarının yanlış sınıflandırılmasını azaltmak üçün yalnızca en geniş kesit çapı yaklaşık 15 µm və ya daha böyük olan mast hüceyrələri dəyərlendirilmiştir.

Toplam 18 doku kesitinin analizinde antijen uygulanmamış siçanlarda mast hüceyrələrinin %90’dan fazlası dinlenme morfolojisindedir. Tedavisiz antijen grubunda hüceyrələrin böyük çoğunluğu yaygın degranülasyon göstərmişdir. LPS və BSS gruplarında yaygın degranülasyon gösteren hüceyrələrin nisbəti %20’nin altında kalmıştır.

IFNAR1 eksik siçanlarda ise tedaviden müstəqil kimi antijen sonrasında mast hüceyrələrinin %70’ten fazlası yaygın degranülasyon göstərmişdir. Bu nəticə, histologiyak korumanın da IFNAR sinyaline bağlı olduğunu destəklemektedir.

Sitokalazin D təcrübəi aktin mexanizmsını nasıl sınamıştır?

Sitokalazin D, aktin filamentlerinin dinamiğini değiştiren bir biləşiktir. Araştırmacılar LPS, BSS və ya deksametazon uygulanmış siçanlardan peritoneal hüceyrələri almış və hüceyrələri antijenle uyarmadan əvvəl aşağı nanomolar sitokalazin D ilə 20 dakika muamele etmiştir.

LPS və BSS uygulanan heyvanlardan alınan hüceyrəlerde antijenle tetiklenen histamin salımı aşağıtür. Kısa müddətli 20 nM sitokalazin D tətbiqsı histamin salımını yeniden yükseltmiştir. Bu geri dönüş deksametazon grubunda görülmemiştir.

IFNAR1 eksik hüceyrəlerde sitokalazin D’nin LPS və BSS’ye özgü geri çevirme etkisi bulunmamıştır. Bulgular, mikrobiyal uyarıcıların mast hüceyrəsini kortikal aktin dinamiği üzerinden baskıladığı görüşünü destəklemektedir.

Tədqiqatda salınan histaminin toplam histamine nisbəti istifadə edilmişdir. Bu hesaplama temel kimi şu biçimde ifade ediləbilir:

\[ Histamin\ salımı\ (\%) = \frac{H_{süpernatant}}{H_{süpernatant}+H_{hücre\ içi}} \times 100 \]

H_süpernatant hüceyrə dışına salınan histamini, H_{hüceyrə içi} hüceyrəlerde kalan histamini ifade eder. Sitokalazin D’nin 20 nM dozu LPS və BSS gruplarında bu nisbəti qrafiklerde yaklaşık %30 düzeyinden %45–55 aralığına taşımıştır. Bu dəyərler şəkilden yaklaşık okunmaktadır.

BSS neden LPS’den daha elvərişli görülmüştür?

Her iki uyarıcı anafilaksi meyarlarıni azaltmış olsa da sitokin profilleri fərqlıdır. BSS, IFN-α/β genlerini güçlü biçimde uyarırken Il-6 və Il-1β artışını sınırlı tutmuştur. LPS ise özellikle yüksək dozda güçlü proinflamatuvar gen transkripsiyonu oluşturmuştur.

Yazarlar, endospor üçündeki bakteriyel RNA’nın fagositoz sonrasında endozomlarda TLR7 və ya TLR13 tarafından algılanabiləceğini; bunun MyD88–IRF7 eksenini və tip I interferonları öne çıkarabiləceğini tartışmaktadır. LPS ise hüceyrə yüzeyindeki TLR4 üzerinden MyD88–NF-κB siqnalını güçlü biçimde başlatarak IL-6 və IL-1β gibi proinflamatuvar sitokinleri artırabilir.

Bu molekulyar algılama yolları mevcut tədqiqatda TLR7, TLR13, TLR4, MyD88, IRF7 və ya NF-κB kaybı təcrübələriyle birbaşa sınanmamıştır. Tartışma bölümündeki mexanizm, əvvəlki literatüre dayanan bir açıqlamadır.

BSS’nin “sepsis benzeri sitokin salımı riski taşımadığı” yönündeki ifade, elde edilən vərilərin sınırını aşmaktadır. Tədqiqat yalnızca belirli genlerin kısa müddətli mRNA yanıtını ölçmüştür. Sitokin zülalleri, ateş, kan basıncı, organ hasarı, tam kan sayımı, uzun dönem inflamasyon və ya insan təhlükəsizği dəyərlendirilmemiştir.

Tədqiqatnın güçlü yönleri nelerdir?

• Sistemik və kutanöz olmak üzere iki ayrı IgE aracılı anafilaksi modeli istifadə edilmişdir.
• Vücut sıcaklığı, MCPT-1, damar sızıntısı, ödem, histologiya və histamin salımı gibi birbirini tamamlayan ölçütler incelenmiştir.
• IFNAR1 eksik siçanlar kullanılarak reseptör asılılığı genetik kimi sınanmıştır.
• Serotonin və histaminle mast hüceyrəsini atlayan kontrol təcrübəi konstruksiyalmıştır.
• Terbinafin, mevalonolakton, farnesol və skualen kullanılarak metabolik yolun fərqlı basamaklarına müdahale edilmiştir.
• Mast hüceyrəsi morfolojisi doku üçünde dəyərlendirilmiş və degranülasyon sınıflandırılmıştır.
• Sitokalazin D təcrübəi, aktin dinamiğiyle ilgili mexanizmyı işlevsel bir geri çevirme yaklaşımıyla sınamıştır.
• LPS ilə BSS’nin interferon və proinflamatuvar sitokin profilleri qarşılaştırılmıştır.

Tədqiqatnın əhəmiyyətli məhdudiyyətləri nelerdir?

• Araştırma yalnızca erkek, 6–10 haftalık siçanlarda konstruksiyalmıştır; dişi heyvanlar və fərqlı yaş grupları dəyərlendirilmemiştir.
• Pasif anafilaksi modelleri doğal duyarlanma müddətcini və insan alerjik hastalıklarının bütün biyolojisini temsil etmez.
• LPS və BSS, reaksiyondan əvvəl iki gün tətbiq edilmişdir. Tədqiqat başlamış anafilaksinin acil tedavisini incelememiştir.
• Deney gruplarındaki toplam heyvan sayıları üsul bölümünde açıq və toplu biçimde vərilmemiştir.
• Rastgele grup ataması, tədqiqatçı körlemesi və əvvəlden konstruksiyalmış güç analizi raporlanmamıştır.
• RT-qPCR təknik kimi üçlü yürütülmüş olsa da müstəqil bioloji təkrar sayıları bütün təcrübələr üçün açıqça sunulmamıştır.
• Tip I interferonlar və proinflamatuvar sitokinler zülal səviyyəsinde ölçülməmişdir.
• Lanosterol, HMGCR zülali, IPP, FPP, GGPP və zülal prenilasyonu birbaşa ölçülməmişdir.
• Kortikal F-aktin dinamiği canlı mast hüceyrələrinde birbaşa görüntülenmemiştir.
• LAT–PLC-γ1 kompleksleri, PLC-γ1 fosforilasyonu və kalsiyum girişi bu tədqiqatda ölçülməmişdir.
• BSS üçün uzun dönem toksisite, təkrar dozlama, spor çimlenmesi, doku dağılımı və immünojenisite dəyərlendirilmemiştir.
• LPS’nin burun içi təhlükəsizğiyle ilgili insan vərisi bulunmamaktadır.
• Deksametazonla benzerlik formal ekvivalentlik testiyle gösterilmemiştir.
• Metinde “nonparametric one-way ANOVA” və ardından Tukey çoklu qarşılaştırma testi yazılmıştır. Kullanılan testin klasik parametrik tək yönlü ANOVA mı, yoksa başka bir nonparametrik yaklaşım mı olduğu açıq değildir.
• Tədqiqatda atıf konstruksiyalan Ek Şəkil S1–S3, incelenen ana sürümün üçünde bulunmamaktadır; bu nedenle bazı destəkleyici analizler görsel kimi doğrulanamamıştır.
• Veri paylaşımına ilişkin açıq bir vəri erişiləbilirliği beyanı bulunmamaktadır.

Tədqiqatın dəstəklədiyi nəticələr

• Burun içi LPS və BSS ön tətbiqsı, istifadə olunan fare modellerinde IgE aracılı sistemik və kutanöz anafilaksi meyarlarıni azaltmışdır.
• LPS və BSS’nin qoruyucu təsirsi IFNAR1 siqnalının varlığına bağlıdır.
• Tedavilər mast hüceyrələrinde Cyp51a1 və Hmgcr mRNA düzeylerini IFNAR’a asılı biçimde azaltmışdır.
• Terbinafin, mevalonolakton və farnesol müdahaleleri koruyucu fenotipi geri çevirmiştir.
• Skualenin qoruyucu təsiryi geri çevirmemesi, sterol dışı mevalonat ürünlerinin önemini destəklemiştir.
• LPS və BSS doku mast hüceyrələrinde yaygın degranülasyon nisbətinı azaltmışdır.
• Düşük doz sitokalazin D, LPS və BSS sonrasında baskılanmış histamin salımını yeniden artırmışdır.
• BSS, incelenen kısa müddətli gen ifadəsi ölçümlerinde LPS’ye göre daha aşağı Il-6 və Il-1β yanıtı oluşturmuştur.

Tədqiqatnın destəklemediği və ya kanıtlamadığı nəticələr

• BSS və ya LPS’nin insanlarda anafilaksiyi önlediği ya da tedavi ettiği gösterilmemiştir.
• Burun üçüne endospor və ya LPS uygulanmasının insanlarda təhlükəsiz olduğu kanıtlanmamıştır.
• BSS’nin sepsis, ateş və ya başka sistemik yan etkilər oluşturmayacağı gösterilmemiştir.
• Tədqiqat astım, gıda alerjisi və ya atopik dermatitte klinik başarı kanıtı sunmamaktadır.
• BSS standart acil anafilaksi tedavilərinin alternatifi kimi dəyərlendirilmemiştir.
• Endosporların “probiyotik” kimi burundan kullanılabiləceği klinik kimi doğrulanmamışdır.
• Mevalonat yolundaki bütün ara ürünlerin gerçekten azaldığı birbaşa biyokimyəvi ölçümle gösterilmemiştir.
• Protein prenilasyonu və kortikal F-aktin düzenlenmesi birbaşa molekulyar görüntüleme ilə kanıtlanmamıştır.
• Çiftlik ortamında yaşayan insanlardaki aşağı alerji riskinin bu tək mexanizmyla açıqlanabiləceği gösterilmemiştir.
• İki günlük ön tətbiqnın uzun müddətli alerji koruması oluşturduğu gösterilmemiştir.

Gelecekte hangi doğrulamalara ihtiyaç vardır?

Bir sonraki aşamada dişi və erkek heyvanları içeren, müstəqil laboratoriyalarda təkrarlanan və əvvəlden kaydedilmiş təcrübələre ihtiyaç vardır. Doğal duyarlanma modelleri, gıda alerjisi, astım və atopik dermatit gibi fərqlı hastalık modelleri ayrı ayrı sınanmalıdır.

Önerilən mexanizmnın güçlendirilmesi üçün IFN-α/β zülal düzeyleri, lanosterol və mevalonat yolu metabolitleri, HMGCR zülal miktarı, kiçik GTPaz prenilasyonu, F-aktin dinamiği, PLC-γ1 aktivasyonu və kalsiyum akışı birbaşa ölçülmelidir.

BSS’nin geliştirilmesi düşünülüyorsa endospor saflığı, çimlenme yeteneği, genetik kararlılık, doku dağılımı, akciğer histologiyasi, təkrarlanan doz toksisitesi, immünojenisite və sporların ortamdan temizlenmesi gibi təhlükəsizlik başlıkları incelenmelidir.

İnsan tədqiqatlarına geçilmeden əvvəl uygun farmasötik form, doz, tətbiq sıklığı və geri çevrilməlü yan etkilər belirlenmelidir. Mevcut nəticələr klinik kullanım kararı vərmek üçün yeterli değildir.

Tədqiqatın üsulu və nəticələri

Araştırma modeli

Ana dozlar və təcrübə koşulları

Deneysel ölçütler

Şəkillerin bilimsel mesajı

Kanıt zincirinin birbaşa və dolayı basamakları

İstatistiksel dəyərlendirme

Yazarlar analizleri GraphPad Prism 6 ilə gerçekleştirmiş, çoklu gruplar arasındaki fərqlar üçün “nonparametric one-way ANOVA” və ardından Tukey çoklu qarşılaştırma testi kullandıklarını belirtmiştir. İstatistiksel anlamlılık eşiği p < 0,05’tir.

Bu ifade üsulsel açıdan yeterince açıq değildir. Klasik tək yönlü ANOVA parametrik bir testtir; yaygın nonparametrik qarşılığı Kruskal–Wallis testidir və genellikle Tukey testiyle değil Dunn gibi bir post hoc testle eşleştirilir. Tədqiqat istifadə olunan işlemin tam yazılım seçeneğini, normallik testini və ya varyans varsayımını açıqlamamaktadır.

Grafiklerde bireysel vəri noktaları gösterilmiş olsa da bütün təcrübələr üçün heyvan sayıları, etki böyüklükleri, güvən aralıkları və kesin p dəyərleri metinde toplu kimi vərilmemiştir. Bu eksiklik nəticələrın təkrarlanabilirliğini və istatistiksel gücünü dəyərlendirmeyi zorlaştırmaktadır.

Mənbə və üsul qeydi

Tədqiqatnın tam özgün adı:Microbial endospores protect against anaphylaxis via interferon-α/β–induced mevalonate pathway inhibition and cortical F-actin stabilization in mast cells

Yazarlar və sıralamaları: Liu Ye, Rema Naskar və Inkyu Hwang.

Eş katkı bilgisi: Liu Ye’nin adının yanında yıldız işareti mövcuddur; lakin işaretin açıqlaması incelenen sürümde yer almır. Eş birinci yazarlık doğrulanamamıştır.

Sorumlu yazar: Inkyu Hwang, Ph.D.; hwanginkyu@cnu.ac.kr.

Diğer yazar ilətişim bilgiləri: Liu Ye: liuye1995@navər.com; Rema Naskar: rema.naskar@gmail.com.

Kurum: Laboratory of Immunology and Immunopharmacology, College of Pharmacy, Chungnam National Univərsity, 99 Daehak-ro, Yuseong-gu, Daejeon 34134, Güney Kore.

DOI: 10.2139/ssrn.6953967.

Dergi: Hakemli bir dergide yayımlandığı və ya kabul edildiği doğrulanmamışdır.

Yayın platformu: SSRN.

Özgün yayınevi: Hakemli dergi yayınevi bulunmamaktadır. Tədqiqat SSRN erken tədqiqat platformunda yayımlanmıştır.

Yayın yılı: 2026.

Kaynak türü: Farelerde in vivo pasif anafilaksi təcrübələri, genetik IFNAR1 eksikliği, farmakolojik yol müdahaleleri, doku histologiyasi və ex vivo mast hüceyrəsi işlev testlerini birleştiren preprint heyvan tədqiqatsı.

Hakemlik durumu: Bu tədqiqat hakem dəyərlendirmesinden geçmemiş bir preprinttir; nəticələrı bu məhdudiyyət dikkate alınarak okunmalıdır.

Resmî bağlantı:SSRN resmî tədqiqat kaydı

Yazar katkıları: Liu Ye tədqiqat, biçimsel analiz və vəri düzenleme; Rema Naskar tədqiqat, biçimsel analiz və vəri düzenleme; Inkyu Hwang özgün metnin yazımı, danışmanlık, finansman temini, vəri düzenleme və kavramsallaştırma görevlerini üstlenmiştir.

Finansman: Tədqiqat National Research Foundation of Korea tarafından NRF-2019R1F1A1061894 və NRF-2019M3A9G4067293 numaralı destəklerle; Chungnam National Univərsity tarafından 2024–1076-01 və 2022–0663-01 numaralı destəklerle finanse edilmiştir. Rema Naskar və Liu Ye’nin BK21 Four və CNU-Star Fellowship programlarından destək aldığı göstərilmişdir.

Çıkar çatışması: Yazarlar tədqiqatyı etkiləyebiləcek bilinen bir mali çıkar və ya kişisel ilişki bildirmemiştir.

Etik onay: Hayvan təcrübələri Chungnam National Univərsity Institutional Animal Care and Use Committee tarafından CNU-00996 protokol numarasıyla onaylanmıştır.

Bu Türkçe makale; yüklenen tədqiqatnın ana metni, üsulleri, təcrübə koşulları, gen ifadeleri, farmakolojik müdahaleleri, histologiya görüntüleri və altı ana şekli incelenerek hazırlanmıştır. Bilimsel anlatı tədqiqatnın sunduğu vəri və yazar yorumlarıyla sınırlandırılmış, dış kaynaklardan yeni bilimsel bulgu eklenmemiştir. Dış kontrol yalnızca başlık, DOI, platform və yayın durumunun bibliyoqrafik doğrulanması üçün istifadə edilmişdir.

Tədqiqat insanlarda klinik etki kanıtı değildir. Burun üçüne LPS və ya canlılık gösterebilən bakteri endosporları uygulanmasını önermemektedir. LPS güçlü bir mikrobiyal inflamasyon uyarıcısıdır və tədqiqatnın kendi nəticələrında proinflamatuvar genleri artırmışdır. BSS üçün bildirilən daha aşağı kısa müddətli sitokin transkripsiyonu, kapsamlı təhlükəsizlik və ya insanlarda kullanım onayı anlamına gelmez.

Tədqiqatnın başlıca məhdudiyyətləri; yalnızca erkək siçanlarin kullanılması, pasif anafilaksi modelleri, önleyici tətbiq düzeni, grup böyüklüklerinin açıq raporlanmaması, uzun dönem təhlükəsizlik vərisinin bulunmaması, sitokin və metabolitlerin zülal/kimyəvi düzeyde ölçülmemesi, mexanizmnın bazı basamaklarının dolayı çıkarıma dayanması, istatistik üsulinin belirsiz yazılması və ek şəkillerin incelenen sürümde bulunmamasıdır.