Karmaşık bitki mənşəli formullerin hangi komponentlerinin biyolojik etkiləre katkı sağladığını belirlemek, tek komponentli dərmanların analizinden çok daha zordur. Bir bitki mənşəli formul yüzlerce fərqlı molekül daxilierebilir; bu moleküller polarite, sabitlik, miktar, bağırsaqtan geciş və metabolizmya uğrama bdaxiliimleri bakımından birbirinden ayrılır.

Geleneksel analitik yaklaşımlarda əvvəl formülün kimyasal biləşimi belirlenir, ardından qanda dəyişmeden bulunan “prototip” komponentler araştırılır. Ancak bir biləşiğin qanda özgün moleküler yapısıyla bulunmaması, onun etkisiz olduğu mənasına gəlməyə bilər. Bazı biləşikler bağırsaq bakteriyaları tarafından parçalanabilir, şekeri uzaklaştırılabilir, reduksiya oluna bilər və ya başka metabolitlere dönüştürülebilir. Oluşan ürün, ana biləşikten daha kolay emiləbilir və ya fərqlı biyolojik özelliklere sahip ola bilər.

Xi Chen və tədqiqat arkadaşları, bu analitik kör noktayı azaltmak amacıyla bağırsaq mikrobiotasını birbaşa komponent eleme stratejisine dahil eden bir iş akışı geliştirmiştir. Metod, hiperurikemiya və gut üçün ənənəvi olaraq kullanılan doqquz bitkili Qu-Zhuo-Tong-Bi dekoksiyau, kısaca QZTBD üzərinde bir kavram qanıtlama tədqiqatsı olaraq tətbiq edilmişdir.

İlk aşamada QZTBD’nin kapsamlı kimyəvi profili UPLC-Q-TOF-MS^E ilə çıkarılmış və toplam 221 komponent tanımlanmış və ya müvəqqəti olaraq izah edilmişdir. Bu komponentler arasında 51 terpen, 46 flavonoid, 32 alkaloid, 30 fenol, 11 lipid, 9 amino turşu və türevi, 9 kumarin, 5 steroid, 4 karbohidrat, 3 organik turşu, 3 saponin, 2 lignan və 16 diğer komponent bulunmaktadır.

QZTBD məlumatlen sıçanların serumları incelendiğinde 221 komponentin yalnız 42’si dəyişmemiş prototip bdaxiliiminde sistemik dövranda aşkar edilmişdir. Başka bir ifadeyle formülde belirlenen komponentlerin təxminən yüzde 19’u prototip olaraq serumda görülmüş, təxminən yüzde 81’i oluşturan 179 komponent özgün bdaxiliimiyle saptanmamıştır.

Araşdırmacılar bu 179 komponenti birbaşa “etkisiz” kabul etmek yerine iki aşamalı bağırsaq mikrobiotası taramasına almıştır. İlk aşamada normal bağırsaq mikrobiotasına sahip QZTBD məlumatlen sıçanlarla, geniş spektrumlu antibiotik kokteyliyle mikrobiotası azaltılan QZTBD məlumatlen sıçanların nəcis profilleri qarşılaştırılmıştır.

Antibiotik məlumatlen sıçanların nəcissında 19 komponentin sinyali yüksəlmiştir. Araşdırmacılar bu birikimi, normal koşullarda söz konusu komponentlerin bağırsaq mikroorqanizmləri tarafından tüketiləbildiği, parçalanabildiği və ya dönüştürülebildiği yönünde bir işaret olaraq yorumlamıştır. Mikrobiota azaltıldığında bu kullanım və ya dönüşüm azalmış və ana komponentler nəcisda daha çox kalmış ola bilər.

İkinci aşamada bu 19 aday, 25–47 yaşları arasındaki 62 erkek gut pasiyentsından elde edilən nəcis mikrobiotasıyla anaerob ortamda 72 saat inkübe edilmiştir. Mikrobiota ehtiva edən ortam ilə mikroorqanizm bulunmayan kontrol ortamı qarşılaştırıldığında dokuz komponentin sinyali əhəmiyyətli bdaxiliimde azalmıştır.

Bu dokuz komponent; quercitrin, sweroside, hesperidin, 3-caffeoylshikimic acid, diosmin, avicularin, engeletin, 5-O-caffeoylshikimic acid və dehydrocorydaline olaraq göstərilmişdir. Ancak bunlar yapısı belirlenmiş mikrob metabolitilər deyil. Tədqiqat yalnız ana komponent sinyalinin mikrobiota varlığında azaldığını göstərir.

Serumda prototip olaraq bulunan sekiz temsilci ilə mikrobiota dönüşümüne aday komponentler arasından, farmakolojik ilgi və referans standart bulunabilirliği de dikkate alınarak 15 komponent hədəfli nicel analiz paneline seçilmiştir. Bu panel; engeletin, avicularin, corydaline, D-tetrahydropalmatine, proline betaine, quercitrin, astilbin, luteolin, diosmin, hesperidin, oxypeucedanin hydrate, palmatine, dioscin, sweroside və dehydrocorydaline’den ibarətdir.

Bu 15 komponentin eyni analizde ölçülmesi üçün üçlü kvadrupol LC-MS/MS cihazında çoklu reaksiya izleme, yani MRM metodi geliştirilmiştir. Metod spesifiklik, xəttilik, miqdar təyini həddi, cihaz kəsiknliği, gün daxilii və günlərarası dəqiqlik, təkrarlana bilərlik, geri qazanım və 24 saatlik məhlul kararlılığı açısından dəyərlendirilmiştir.

QZTBD nümunəlerinde en yüksek miktarlarda bulunan komponentler genel olaraq astilbin, engeletin, quercitrin və proline betaine olmuştur. Tablo 2’deki 15 nümunəte astilbin təxminən 107,203–315,430 µg/g, engeletin 22,925–105,325 µg/g, quercitrin 28,584–97,616 µg/g və proline betaine 8,285–41,809 µg/g aralıklarında bildirilmişdir.

Tədqiqatnın son aşamasında bağırsaq mikrobiotasının QZTBD’nin farmakodinamik etkisine katkısı, yüksək yağlı pəhriz və mononatrium urat kristaliyle oluşturulan gut benzeri sdaxilian modelinde incələnmişdir. QZTBD uygulaması serum sidik turşusuni və kreatinini azaltmış; iltihab göstergelerinde, ayaq şişməsinde və meqanik ağrı hassasiyetinde iyiləşmeyle ilişkiləndirilmiştir.

Bağırsaq mikrobiotası antibiotiklerle azaltıldığında bu iyiləşmelerin bir bölməü zəiflamıştır. Bu nəticə, QZTBD’nin sdaxilian modelindeki etkisinin en azından kısmen bağırsaq mikrobiotasıyla əlaqəli olabiləceğini desteklemektedir.

Bununla belə antibiotik deneyi belirli bir bakterinin, enzimin və ya metabolitin nedensel rolünü göstermemektedir. Antibiotikler mikrobiotayı geniş çapta dəyiştirebilir və konak fizyolojisini birbaşa da etkiləyebilir. Ayrıca tek tek seçilmiş 15 komponentin və ya mikrobiyal dönüşüm ürünlerinin hayvanlara məlumatlerek etkinliklerinin sınandığı bir deney yapılmamıştır.

Tədqiqatnın temel katkısı yeni bir gut müalicəsini klinik olaraq qanıtlamak değil; karmaşık bitki mənşəli formullerde yalnız qanda dəyişmeden görülen moleküllere odaklanmanın yetersiz olabiləceğini və bağırsaq mikrobiotasıyla dönüşme olasılığının analitik komponent seçimine dahil ediləbiləceğini göstermektir.

Karmaşık bitki mənşəli formullerde “aktif komponent” neden kolayca belirlenemiyor?

Tək bir saf kimyasal maddə ehtiva edən dərmanta analiz ediləcek ana molekül bellidir. Buna qarşılık bir bitkisel dekoksiya:

• Birden çox bitkiden,
• Yüzlerce ana və yan komponentden,
• Fərqlı polaritedeki moleküllerden,
• Şeker taşıyan qlikozidlerden,
• Alkaloidlerden, flavonoidlerden və terpenlerden,
• Suda çözünen və yağda çözünen fraksiyonlardan oluşabilir.

Bir komponentin formül üçünde bol bulunması, bağırsaqtan dəyişmeden emiləceği mənasına gəlmir. Tersine, formülde düşük miktarda bulunan bir molekül yüksek emilim və ya güclü biyolojik aktivite gösterebilir.

Özellikle qlikozidler, saponinler və qələviı yüksek polariteli moleküller bağırsaq zarından prototip bdaxiliiminde məhdud gecebilir. Bu biləşiklerin şəkər qrupları bağırsaq mikroorqanizmlərinın enzimleri tarafından uzaklaştırıldığında daha küçük və daha lipofilik aqlikonlar oluşabilir.

Bu səbəbdən üç ayrı sual birbirinden ayrılmalıdır:

1. Formülde hangi moleküller bulunuyor?
2. Bu moleküllerden hangiləri dəyişmeden qana geciyor?
3. Değişmeden qana gecmeyenlerden hangiləri bağırsaqta biyolojik açıdan əhəmiyyətli ürünlere dönüşebilir?

Tədqiqatnın yenilik iddiası özellikle üçüncü sualyu analitik iş akışına dahil etmesidir.

Prototip komponent ilə çevrilmə prekursual arasındaki fərq

“Prototip emilmiş komponent”, formülde bulunduğu kimyasal bdaxiliimle serumda saptanan moleküldür. Örneğin molekülün moleküler kütlesi, saxlanma vaxtı və MS/MS fraqmentləşmə nümunəsi formüldeki standartla uyğunysa prototip olaraq emildiği kabul edilir.

“Prototip olaraq emilmeyen komponent” ise formülde belirlenmesine rağmen serumda eyni bdaxiliimiyle aşkar edilməyən moleküldür. Bunun birkaç olası səbəbi vardır:

• Bağırsaqtan hdaxili emilmemesi,
• Bağırsaq mikroorqanizmlarınca dönüştürülmesi,
• Bağırsaq hüceyrəlerinde metabolize edilmesi,
• Karaciğer ilk geciş metabolizmsına uğraması,
• Nəcisyla dəyişmeden atılması,
• Analitik aşkarlama həddinın altında kalması,
• Nümunəleme zamanında serumda bulunmaması.

Dolayısıyla “serumda prototip yok” sonucu, “farmakolojik katkısı yok” sonucuyla eyni deyil.

Bağırsaq mikroorqanizmları molekülleri nasıl dəyiştirebilir?

Tədqiqatda bağırsaq mikrobiotasının geniş bir enzim repertuvarına sahip olduğu vurgulanmaktadır. Bunlar arasında:

• β-qlükozidaza,
• β-qlükuronidaza,
• Nitroreduktaza,
• Redüktaz,
• Esteraz və benzeri mikrobiyal enzimler bulunmaktadır.

Bu enzimler şeker bağlarını kesebilir, esterleri hidroliz edebilir, qələviı fonksiyonel grupları indirgeme və ya oksidləşmə reaksiyalarına sokabilir. Böylece ana biləşiğin moleküler büyüklüğü, çözünürlüğü və biyolojik hədəflerle etkiləşimi dəyişebilir.

Ancak mevcut tədqiqat bu enzimlerin hangisinin QZTBD komponentlerinden hangisini dönüştürdüğünü ölçmemiştir. Mikrobiota aracılı dönüşüm, komponent sinyalindeki dəyişime dayalı olaraq əvvəlliklendirilmiştir.

Qu-Zhuo-Tong-Bi dekoksiyau hangi bitkilərden oluşuyor?

QZTBD dokuz bitkisel komponentden hazırlanmıştır:

Bitkilər əvvəl hacimlerinin on katı deiyonize suda bir saat bekletilmiş və 40 dakika kaynatılmıştır. Kalan bitki posası daha sonra sekiz hacim suyla 30 dakika ikinci kez kaynatılmıştır. İki filtrat birleştirilmiş, süzülmüş, yoğunlaştırılmış və 4°C’de saklanmıştır.

Tədqiqatnın bütünleşik iş akışı

Araşdırma beş ana analitik və biyolojik katmanı birleştirmektedir:

1. Kapsamlı kimyəvi profil: QZTBD’deki mümkün olduğunca çox komponentin UPLC-Q-TOF-MS^E ilə belirlenmesi.
2. Serum məruz qalma analizi: Sıçan serumunda dəyişmeden bulunan prototip komponentlerin seçilmesi.
3. Mikrobiota dönüşüm taraması: Prototip olaraq serumda bulunmayan komponentlerin antibiotik deneyi və insan nəcis mikrobiotası inkubasiyauyla dəyərlendirilmesi.
4. Hedefli nicel analiz: Seçilmiş 15 komponentin LC-MS/MS-MRM metodiyle eyni vaxtda ölçülmesi.
5. Farmakodinamik düzgünlama: Gut benzeri sdaxilian modelinde mikrobiota azaltılmasının QZTBD etkisini dəyiştirip dəyiştirmediğinin incelenmesi.

Şəkil 6A bu iş akışını görsel olaraq özetlemektedir. Formülde bulunan komponentler əvvəl prototip emilənler və prototip emilmeyenler olaraq ayrılmakta; ikinci grup, canlı sıçan nəcissı müqayisəsı və laboratuvar ortamındaki insan mikrobiotası inkubasiyauyla yeniden süzülmektedir.

UPLC-Q-TOF-MS^E neden kullanıldı?

UPLC, komponentleri kolonda ayırırken Q-TOF kütle spektrometresi iyonların yüksek dəqiqlikla kütlə/yük nisbətinı ölçmektedir.

Tədqiqatnın mantığını izahk üçün kütle spektrometrisindeki temel ilişki şöyle gösteriləbilir:

\[ m/z = \frac{\text{iyonun kütlesi}}{\text{iyonun yük sayısı}} \]

• m, iyonun kütlesini,
• z, iyonun elektriksel yükünü ifade eder.

MS^E alımında düşük və yüksek toqquşma enerjisi məlumatleri eyni analiz üçünde elde edilir. Düşük enerjili məlumat ana iyonu, yüksek enerjili məlumat ise parçalanma ürünlerini göstermeye yardımcı olur.

Bu özellik karmaşık karışımlarda yararlıdır; çünki yalnız moleküler kütleye değil, fraqmentləşmə davranışına da bakılarak quruluş təklifi geliştiriləbilir.

UPLC-Q-TOF-MS^E koşulları

221 komponentin kimyasal dağılımı

Kütle hatalarının önerilən prekursor ionlar üçün ±5 ppm üçünde kaldığı qeyd edilmişdir. Bu dəqiqlik, yapı önerilərini destekler; lakin eyni moleküler formüle sahip izomerlerin yalnız dəqiq kütləyle kəsikn olaraq ayırt edildiği mənasına gəlmir.

Referans standartla müqayisə edilən komponentler daha güclü bdaxiliimde düzgünlanmış, diğer komponentlerin önemli bir bölməü dəqiq kütlə, fraqmentləşmə nümunəsi, məlumat tabanı və literatür müqayisəsıyla müvəqqəti olaraq izah edilmişdir.

Şəkil 1’deki kromatogramlar ne gösteriyor?

Şəkil 1’de QZTBD örneğinin pozitif və neqativ ion modlarındaki qələvi pik yoğunluğu kromatogramları ilə referans standart məhlulsinin kromatogramları birlikte gösterilmektedir.

QZTBD kromatogramlarında analiz müddətine yailmış çok sayıda pik bulunması, formülün kimyasal çeşitliliğini göstərir. Referans standart kromatogramları daha az və belirgin pikler daxilierir. Bu müqayisə, belirli hədəf komponentlerin karmaşık formül üçündeki alıkonma bölgelerini desteklemek amacıyla istifadə edilmişdir.

Flavonoidlerin parçalanma davranışları

Şəkil 2’de luteolin, diosmin, astilbin və engeletinin MS/MS spektrumları və önerilən parçalanma yolları təqdim olunur.

Luteolin

Luteolin negatif ion rejiminda m/z 285,0416 [M−H]⁻ prekursor ionu vermiştir. m/z 151,0040 və 133,0298 iyonları flavon iskeletindeki Retro-Diels–Alder parçalanmasıyla ilişkiləndirilmiştir.

Diosmin

Diosmin m/z 607,1671 [M−H]⁻ iyonu göstermiştir. m/z 299,0561 ürünü, rutinoza grubunun uzaklaşmasıyla oluşan diosmetin aqlikonuyla ilişkiləndirilmiştir.

Astilbin

Astilbin m/z 449,1098 [M−H]⁻ prekursor ionunu oluşturmuştur. Ramnoz kaybından sonra m/z 303,0518 taxifolin aqlikon iyonu; ardından su kaybıyla m/z 285,0413 və RDA parçalanmasıyla m/z 151,0040 iyonları gözlenmiştir.

Engeletin

Engeletinde ramnoza kaybı sonrasında m/z 287,0561 aqlikon iyonu, su kaybıyla m/z 269,0459 və devam eden RDA parçalanmaları bildirilmişdir.

Bu parçalanmalar, flavonoid qlikozidlerde şeker grubunun ayrılmasının yapı tanımlamasında nasıl tanısal bilgi sağladığını göstərir.

Alkaloidlerin parçalanma davranışları

Şəkil 3 palmatine, dehydrocorydaline, corydaline və D-tetrahydropalmatine üçün pozitif ion rejimindaki parçalanma desenlerini göstərir.

• Palmatine: m/z 352,1542 [M]⁺ prekursor ionundan CH₄ və CO kayıplarıyla m/z 336,1228 və 308,1279 iyonları oluşmuştur.
• Dehydrocorydaline: m/z 366,1703 [M]⁺ iyonundan m/z 350,1393, 322,1441 və 306,1136 ürünleri bildirilmişdir.
• Corydaline: m/z 370,2014 [M+H]⁺ prekursor ionundan m/z 354,1703 və tanısal m/z 192,1019 iyonu oluşmuştur.
• D-tetrahydropalmatine: m/z 356,1861 [M+H]⁺ iyonu; m/z 324,1237, 192,1020 və 176,0708 ürünlerini vermiştir.

Araşdırmacılar bu alkaloidlerin özellikle Yanhusuo bitkisiyle əlaqəli olduğunu və formülün olası ağrı ilə iltihab bağlantılı komponentleri arasında dəyərlendiriləbiləceğini tartımmıştır. Ancak bu tədqiqatda söz konusu alkaloidler tek başlarına ağrı deneyinde sınanmamıştır.

Diğer yapı sınıflarından nümunəler

Şəkil 4’te üç fərqlı yapı sınıfı gösterilmektedir:

• Sweroside: İridoid qlikozid; m/z 359,1341 [M+H]⁺ və qlükoza kaybıyla m/z 197,0807.
• Dioscin: Steroidal saponin; m/z 869,4903 [M+H]⁺ və arxariciık şeker kayıplarıyla m/z 723,4312, 577,3742 və 415,3211.
• Oxypeucedanin hydrate: m/z 305,1021 [M+H]⁺; C₅H₁₀O₂ kaybıyla m/z 203,0341 və devamında m/z 147,0340.

Serumda prototip məruz qalma nasıl belirlendi?

QZTBD məlumatlen sıçanların serum profilleri kontrol serumuyla qarşılaştırılmıştır. Bir komponentin prototip olaraq emildiğinin kabul edilmesi üçün temel ölçütler şunlardır:

• Dərman məlumatlen serumda bulunması və boş serum yanıtının en az iki katına ulaşması,
• QZTBD ekstraktındaki ilgili komponentle uyğun saxlanma vaxtı,
• Doğru kütle və moleküler formül uyumu,
• Benzer MS/MS fraqmentləşmə davranışı.

Şəkil 5’teki serum kromatogramı, özgün QZTBD ekstraktındaki çok yoğun pik yapısına kıyasla daha məhdud sayıda tanımlanmış prototip komponent göstərir.

42 prototip komponent hangi sınıflardan oluştu?

• 10 terpenoid,
• 9 alkaloid,
• 8 flavonoid,
• 5 fenol,
• 4 kumarin,
• Birer organik turşu, karbohidrat, amino turşu, steroid, antrakinon və saponin.

Serum məruz qalmai, farmakolojik ilgi və referans standart bulunabilirliği dikkate alınarak sekiz prototip temsilci seçilmiştir:

• Corydaline,
• D-tetrahydropalmatine,
• Palmatine,
• Astilbin,
• Luteolin,
• Oxypeucedanin hydrate,
• Proline betaine,
• Dioscin.

Antibiotikle mikrobiota azaltma deneyi

Serum və nəcis komponent analizi üçün 24 erkek SD sıçan dört gruba ayrılmıştır; her grupta altı hayvan bulunmaktadır:

Antibiotik kokteyli 14 gün boyunca daxilime suyunda şu maddəleri daxiliermiştir:

• Vancomycin: 0,5 g/L,
• Ampicillin: 0,1 g/L,
• Neomycin: 1,0 g/L,
• Metronidazole: 1,0 g/L.

Ek görselde normal və antibiotik tətbiq edilmiş sıçan ilə sdaxilian nəcis nümunəlerinin kültür plakaları qarşılaştırılmaktadır. Normal gruplarda yoğun koloni oluşumu görülürken antibiotik gruplarında belirgin azalma bulunmaktadır. Bu, kültüre alınabilən bakterilərin azaldığını destekler; bağırsaq ortamının tamamen steril hâle geldiğini göstermez.

Neden antibiotik grubunda artan nəcis komponentleri önemli?

Normal mikrobiota bir ana komponenti tüketiyor və ya başka ürüne dönüştürüyorsa, antibiotikle bu işlem azaltıldığında ana komponent nəcisda daha çox kalabilir.

Bu mantık şöyle xülasə edilə bilər:

\[ \text{Normal mikrobiyota: ana bileşen} \rightarrow \text{tüketim veya dönüşüm} \]

\[ \text{Mikrobiyota azaldığında: daha fazla dönüşmemiş ana bileşen} \]

Tədqiqatda 19 komponentin ABX + QZTBD grubunun nəcissında normal QZTBD grubuna göre arttığı belirlenmiştir. Ancak artımın səbəbi yalnız mikrobiyal dönüşüm olmayabilir; bağırsaq hareketleri, emilim, antibiotiklerin konak metabolizmsına etkisi və ya nəcis biləşimi de sonucu etkiləyebilir.

Gut pasiyentlarından alınan nəcis mikrobiotasıyla in vitro deney

İnsan nəcis nümunəleri 25–47 yaşlarında, gut artriti tanısı bulunan 62 erkek iştirakçıdan alınmıştır. İştirakçılardan bilgiləndirilmiş onam alındığı və insan araşdırmasının etik kurul tarafından onaylandığı qeyd edilmişdir.

Nəcis süspansiyonu hazırlığında:

• 200 mg nəcis 800 µL steril PBS üçünde süspanse edilmiştir.
• Büyük parçacıklar 800 × g’de, 4°C’de üç dakika santrifüjle uzaklaştırılmıştır.
• Bakteri süspansiyonu BHI ortamıyla 3 × 10⁹ CFU/mL səviyyəsine ayarlanmıştır.

Üç inkubasiya grubu kurulmuştur:

Nümunəler yüzde 80 N₂, yüzde 10 H₂ və yüzde 10 CO₂ ehtiva edən anaerob ortamda 37°C’de 72 saat inkübe edilmiştir.

Mikrobiota bulunan grupta dokuz ana komponentin sinyali mikrobiotasız kontrole göre əhəmiyyətli bdaxiliimde azalmıştır. Bu azalma söz konusu komponentlerin mikroorqanizmlar tarafından tüketilmiş və ya dönüştürülmüş olabiləceğini desteklemektedir.

Bu dokuz komponent mikrob metaboliti midir?

Hayır. Tədqiqatda özellikle bu ayrım yapılmaktadır. Dokuz komponent, bağırsaq mikrobiotasına yanıt veren potansiyel ana komponentlerdir.

Tədqiqat:

• Oluşan yeni metabolitlerin moleküler yapısını belirlememiştir.
• Hangi bakterinin hangi komponenti dönüştürdüğünü göstermemiştir.
• Dönüşümden sualmlu enzimi tanımlamamıştır.
• Oluşan metabolitin emilip emilmediğini ölçmemiştir.
• Metabolitin ana komponentden daha aktif olduğunu göstermemiştir.

Komponent sinyalinin azalması; biotransformasiya, mikrobiyal tüketim, kimyasal parçalanma və ya hüceyrəlere bağlanma gibi birden çox sürece bağlı ola bilər. Mikrobiotasız ortam kontrolü kendiliğinden parçalanmayı kısmen ayırmaya yardımcı olsa da bütün meqanizmaları izahz.

Neden dokuz adaydan yalnız yedisi hədəfli panele girdi?

Serumdan seçilən sekiz prototip komponente, mikrobiota taramasından gelen yedi komponent eklenerek 15 komponentlik nicel panel yaradılmışdır.

Mikrobiota taramasında belirlenen 3-caffeoylshikimic acid ilə 5-O-caffeoylshikimic acid nihai 15 komponent arasında yer almamaktadır. Tədqiqatnın seçim ölçütleri arasında referans standart bulunabilirliği bulunduğu üçün bu iki komponentin hədəfli nicel panele alınmaması bu ölçütle uyğundur.

Bu durum önemli bir məhdudlığı göstərir: analitik panel yalnız biyolojik öneme göre değil, güvenilir referans standarda erişiləbilmesine göre de şəkillenmiştir.

Bitki eksiltme deneyleri neyi gösterdi?

Seçilmiş komponentlerin hangi bitkiden mənbəlandığını dəyərlendirmek üçün QZTBD’nin tam formülünden tək bir bitkinin çıkarıldığı negatif kontrol dekoksiyaları hazırlanmıştır.

Çıkarılan bitkilər:

• Tufuling,
• Bixie,
• Yiyiren,
• Yanhusuo,
• Foshou’dur.

Şəkil 6E’deki istilik xəritəsina göre:

• Astilbinin ana kaynağı Tufuling olaraq belirlenmiştir.
• Corydaline, D-tetrahydropalmatine və dehydrocorydaline gibi alkaloidlerin temel katkıcısı Yanhusuo’dur.
• Proline betaine və qələviı narenciye əlaqəli flavonoidler Foshou çıkarıldığında azalmıştır.
• Bazı flavonoidler və qlikozidler tək bir bitkiye özgü belirgin desen göstermemiştir.

Bir komponentin tek bitki çıkarıldığında azalması o bitkinin önemli mənbə olduğunu destekler; biləşiğin yalnız o bitkide bulunduğunu kəsikn olaraq göstermez. Birden çox bitki eyni və ya benzer biləşiği sağlayabilir.

Hedefli LC-MS/MS metodinin amacı

UPLC-Q-TOF-MS^E yüzlerce komponenti geniş kapsamlı bdaxiliimde taramak üçün istifadə edilmişdir. Buna qarşılık üçlü kvadrupol LC-MS/MS sistemi seçilmiş komponentleri daha seçici və nicel bdaxiliimde ölçmek amacıyla istifadə edilmişdir.

MRM metodinde ilk kuadrupol belirli bir prekursor ionu seçer, çarpışma hüceyrəsinde iyon parçalanır və üçüncü kuadrupol belirli bir məhsul ionuunu izler. Böylece her komponent üçün “prekursor ion → məhsul ionu” gecişi analitik parmak izi gibi kullanılabilir.

LC-MS/MS analiz koşulları

15 komponent üçün MRM gecişleri

Metod validasiyau nasıl yapıldı?

Hedefli LC-MS/MS metodi şu ölçütlerle dəyərlendirilmiştir:

• Özgüllük: Karma standart, QZTBD örneği və boş həlledici kromatogramlarının qarşılaştırılması.
• Doğrusallık: Pik alanının analit konsentrasiyaine qarşı grafiğe gecirilmesi.
• LOQ: Güvenilir nicel ölçüm yapılabilən en düşük səviyyəsin dəyərlendirilmesi.
• Cihaz kəsiknliği: Aynı məhlulnin art arda altı kez enjeksiyonu.
• Gün daxilii dəqiqlik: Aynı gün üçündeki tekrar analizleri.
• Günler arası dəqiqlik: Üç arxariciık gündeki analizler.
• Tekrarlanabilirlik: Aynı örneğin müstəqil hazırlanan altı tekrarı.
• Geri kazanım: Düşük, orta və yüksek səviyyəde standart ekleme.
• Kararlılık: Aynı örneğin 0, 2, 4, 8, 12 və 24 saat sonra yeniden analizi.

Tədqiqatda geri qazanım şu formülle hesablanmışdır:

\[ \text{Geri kazanım (\%)} = \frac{\text{ölçülen toplam miktar} - \text{başlangıç miktarı}} {\text{eklenen standart miktarı}} \times 100 \]

Yazarlar metodin xəttilik, duyarlılık, dəqiqlik, təkrarlana bilərlik, geri qazanım və sabitlik bakımından tatmin edici olduğunu bildirmiştir. Ancak her analite ait bütün sayısal validasiya dəyərleri ana metinde tek tek məlumatlmemiş; ayrıntılar ek tablolara yönlendirilmiştir.

15 nümunəte ölçülen miktar aralıkları

Aşağıdaki aralıklar Tablo 2’de sunulan 15 QZTBD örneğinin en düşük və en yüksek ortalama dəyərlerinden çıkarılmıştır. Birimler µg/g’dir və bütün QZTBD üretimleri üçün evrensel spesifikasyon olaraq yorumlanmamalıdır.

Bu geniş dəyişim, karmaşık bitki mənşəli formullerde yalnız bir və ya iki yüksek miktarlı belirtecin kullanılmasının bütün kimyasal yapıyı temsil etmeyebiləceğini göstərir.

En bol komponent en önemli komponent midir?

Hayır. Astilbinin miktarı qələviı nümunəlerde yüzlerce µg/g səviyyəsindeyken qələviı alkaloidler 1 µg/g’ın altında aşkar edilmişdir. Buna rağmen düşük miktarlı bir komponent yüksek biyolojik etkinlik gösterebilir və ya kolay emiləbilir.

Tədqiqatnın önerdiği panel bu səbəbdən yalnız miktara göre oluşturulmamıştır. Seçimde:

• Kimyasal sınıf,
• Polarite,
• Serumda prototip məruz qalma,
• Mikrobiotayla dönüşüm olasılığı,
• Farmakolojik ilgi,
• Referans standart bulunabilirliği birlikte dəyərlendirilmiştir.

Farmakodinamik sdaxilian deneyinin tasarımı

Toplam 30 erkek C57BL/6J sdaxilian beş gruba ayrılmıştır; her grupta altı sdaxilian bulunmaktadır:

Model gruplarına yüksək yağlı pəhriz məlumatlmiş və sağ arka ayak tabanına her 10 günde bir 40 µL PBS üçünde 1 mg mononatrium urat kristali enjekte edilmiştir. Müalicə altı hafta sürmüştür.

Hangi nəticəlar ölçüldü?

• Serum ürik turşu səviyyəsi,
• Serum kreatinin səviyyəsi,
• TNF-α,
• IL-6,
• IL-1β,
• NLRP3,
• Ayak şişliği indeksi,
• Von Frey filamentleriyle meqanik ağrı eşiği,
• Karaciğer orqan indeksi,
• Böyrək orqan indeksi.

Ayak şişliği indeksinin tədqiqatdaki temel anlamı şöyledir:

\[ \text{Ayak şişliği indeksi} = \frac{\text{sağ ayak tabanı ölçümü}} {\text{sol ayak tabanı ölçümü}} \]

Sağ ayak MSU enjeksiyonu yapılan taraftır. Oranın yüksəlmesi sağ taraftaki şişmenin arttığını göstərir.

Şəkil 7 ne anlatıyor?

Şəkil 7 çok panelli olaraq bütün farmakodinamik deneyin nəticəlarını sunmaktadır:

• Model grubunda serum sidik turşusu yüksəlmiştir.
• QZTBD uygulaması ürik turşu səviyyəsini düşürmüştür.
• Serum kreatininindeki model əlaqəli artım QZTBD ilə azalmıştır.
• TNF-α, IL-6, IL-1β və NLRP3 nəticəları iltihabun QZTBD ilə baskılandığını desteklemiştir.
• Ayak şişliği və meqanik allodini QZTBD grubunda iyiləşmiştir.
• Antibiotik + QZTBD grubundaki iyiləşme yalnız QZTBD grubuna göre daha zəif kalmıştır.
• Karaciğer və böyrək organ indekslerinde belirgin olumsuz dəyişiklik görülmemiştir.

Antibiotik sonrasında etkinin zəiflaması, QZTBD’nin etkisinin en azından bir bölməünde bağırsaq mikrobiotasının rol oynadığını desteklemektedir. Ancak etki tamamen ortadan kalkmamıştır; dolayısıyla tədqiqat QZTBD’nin yalnız mikrobiota üzərinden etkili olduğunu söylememektedir.

Antibiotik deneyi nedenselliği ne ölçüde gösteriyor?

ABX + QZTBD grubunun QZTBD grubundan daha zəif yanıt vermesi mikrobiota katkısı üçün önemli bir tapıntıdur. Bununla belə geniş spektrumlu antibiotikler:

• Çok sayıda bakteri grubunu eyni anda azaltır,
• Bağırsaq bariyerini dəyiştirebilir,
• Safra asidi və enerji metabolizmsını etkiləyebilir,
• Dərmanların emilimini dəyiştirebilir,
• Konak bağışıklığı üzərinde birbaşa etki oluşturabilir.

Bu səbəbdən nəticə belirli bir bakteri və ya metabolitin nedensel rolünü göstermez. Daha kəsikn nəticəlar üçün mikrobiota transferi, tek bakteri kolonizasyonu, belirli enzim inhibitörleri və ya tanımlanmış metabolit uygulamaları gerekir.

Geçmiş açısından tədqiqatnın önemi

Geleneksel serum farmakokimyası, formülden qana dəyişmeden gecen komponentleri olası aktif maddəler üçün temel aday kabul eder. Bu yaklaşım dövrana giren prototipleri göstermek açısından dəyərlidir; lakin qlikozid və yüksek polariteli biləşiklerin çoğunu xariciarıda bırakabilir.

Bu tədqiqat, serumda görünmeyen komponentlerin bir bölməünü bağırsaq mikrobiotasıyla əlaqəli ikinci bir analitik qanaldan dəyərlendirmiştir. Böylece “serumda yoksa ele” yaklaşımından daha geniş bir əvvəlliklendirme çerçevesi önermiştir.

Bugün açısından önemi

Karmaşık bitkisel preparatların kalite kontrolünde genellikle kolay ölçülen və ya yüksek miktarda bulunan birkaç belirteç seçilir. Bu belirteçler her zaman biyolojik məruz qalmai temsil etmeyebilir.

Tədqiqatnın önerdiği ikili panel:

• Doğrudan emilən prototip komponentleri,
• Bağırsaq mikrobiotasıyla dönüşmeye aday komponentleri eyni nicel metodde bir araya getirmektedir.

Bu yaklaşım gələcəkte botanik ürünlerde kalite kontrol belirteçlerinin yalnız kimyasal bolluğa değil, bioloji istifadə yoluna göre de seçilmesine katkı sağlayabilir.

Gelecek açısından hangi tədqiqatlar gerekiyor?

• Azalan dokuz ana komponentden oluşan gerçek mikrob metabolitilər tanımlanmalıdır.
• Metabolitler yüksək ayırdetməli hədəflenmemiş metabolomikale izlenmelidir.
• Dönüşümden sualmlu bakteri türleri və enzimler belirlenmelidir.
• Karaciğer mikrozomları və bağırsaq hüceyrəsi metabolizmsı da taramaya eklenmelidir.
• Seçilmiş ana komponentler və metabolitler hayvanlarda tek tek uygulanmalıdır.
• Mikrobiota dönüşümünün sistemik məruz qalmai artırıp artırmadığı farmakokinetikle ölçülmelidir.
• İnsanlarda QZTBD kullanımı sonrasında serum, sidik və nəcis metabolomikaleri birlikte dəyərlendirilmelidir.
• Gut pasiyentları ilə sağlıklı bireylerin mikrobiyal dönüşüm kapturşuesi qarşılaştırılmalıdır.
• Fərqlı yaş, cinsiyet, qidalanma və antibiotik gecmişine sahip bireyler incelenmelidir.
• 15 komponentli panel müstəqil laboratuvarlar və fərqlı üretim partilərinde düzgünlanmalıdır.

Gündelik həyat və sağlık açısından nasıl okunmalı?

Tədqiqat QZTBD’nin insanlar üçün qanıtlanmış bir gut müalicəsi olduğunu göstermemektedir. Farmakodinamik məlumatler sdaxilian modelinden gelmektedir və kullanılan QZTBD dozları birbaşa insan dozuna çevriləmez.

Tədqiqatnın gündəlik həyata daha genel katkısı, bağırsaq mikrobiotasının ağızdan alınan karmaşık ürünleri pasif bdaxiliimde geciren bir ortam olmadığını göstermesidir. İnsanların bağırsaq mikroorqanizmləri eyni bitkisel komponenti fərqlı bdaxiliimde dönüştürebilir. Bu durum gələcəkte kişiden kişiye dəyişen yanıtların araştırılmasında önemli ola bilər.

Ancak mevcut tədqiqat kişilər arası müalicə yanıtını, bireyselleştirilmiş dozu və ya klinik başarıyı incelememiştir.

Tədqiqatnın güclü yönleri

• Kimyasal profil, serum məruz qalmai, nəcis analizi, insan mikrobiotası inkubasiyau, hədəfli nicel analiz və farmakodinamik deney eyni çerçevede birleştirilmiştir.
• QZTBD’de 221 komponent geniş kapsamlı olaraq karakterize edilmiştir.
• Pozitif və neqativ ion modları birlikte istifadə edilmişdir.
• Yapı öneriləri dəqiq kütlə və MS/MS parçalanma yollarıyla desteklenmiştir.
• Serumda bulunan prototip komponentlerle bulunmayan komponentler açıkça ayrılmıştır.
• Mikrobiota əlaqəli taramada hem canlı sıçan müqayisəsı hem in vitro insan mikrobiotası istifadə edilmişdir.
• Antibiotik grubu, mikroorqanizm varlığına ilişkin müqayisəlı araç sağlamıştır.
• Mikrobiotasız ortam kontrolü kendiliğinden kimyasal dəyişimi ayırmaya yardımcı olmuştur.
• 15 komponent geniş polarite və yapı aralığını kapsamaktadır.
• Hedefli LC-MS/MS metodi çok sayıda validasiya ölçütüyle dəyərlendirilmiştir.
• Bitki eksiltme deneyleriyle komponentlerin formül üçündeki muhtemel mənbəları araştırılmıştır.
• Farmakodinamik deney bağırsaq mikrobiotasının QZTBD etkisine katkısını işlevsel səviyyəde sınamıştır.
• Tədqiqat adayları “kəsikn aktif maddəler” və ya “qanıtlanmış metabolitler” olaraq değil, əvvəlliklendirilən potansiyel komponentler olaraq sunmuştur.

Tədqiqatnın məhdudlıkları

• Tədqiqat hakem dəyərlendirmesinden gecmemiş bir preprinttir.
• 221 komponentin tamamı referans standartla kəsikn olaraq düzgünlanmamıştır.
• Aynı moleküler kütleye sahip izomerler üçün gecici yapı ataması belirsizlik taşıyabilir.
• Serumda bulunmayan 179 komponentden yalnız dokuzu mikrobiota dönüşüm adayı olaraq əvvəlliklendirilmiştir.
• Kalan 170 komponentin qaraciyər, bağırsaq hüceyrəsi və ya başka metabolik yolları dəyərlendirilmemiştir.
• Nəcisda ana komponentin azalması oluşan metabolitin yapısını göstermez.
• Mikrobiyal metabolitlerin emilimi və ya farmakokinetiği ölçülmemiştir.
• Metabolitlerin biyolojik etkinliği tek tek sınanmamıştır.
• Dönüşümden sualmlu bakteri türleri və ya enzimler tanımlanmamıştır.
• Antibiotik uygulaması belirli mikropları değil, mikrobiyal topluluğun geniş bölməünü dəyiştirmiştir.
• Antibiotiklerin konak üzərindeki birbaşa etkiləri tamamen xaricilanamamıştır.
• İnsan nəcis tədqiqatsı yalnız 25–47 yaşlarında erkek gut pasiyentlarını kapsamıştır.
• Sağlıklı insan nəcis mikrobiotasıyla müqayisə yapılmamıştır.
• İnsan nəcissı yalnız in vitro inkubasiyada istifadə edilmişdir; insanlarda QZTBD müalicəsi uygulanmamıştır.
• Farmakodinamik düzgünlama sdaxilian modeline dayanmaktadır.
• Farelerdeki gut benzeri model insan gut pasiyentlığının bütün özelliklerini temsil etmez.
• Seçilən 15 komponentin hdaxilibiri etkinlik üçün tek başına uygulanmamıştır.
• 15 komponentli panel referans standart bulunabilirliğinden etkilənmiştir.
• İki caffeoylshikimic acid adayı nicel panelin xariciında kalmıştır.
• Validasiyaun bütün analitlere ait ayrıntılı sayısal nəticəları ana metinde sunulmamıştır.
• QZTBD nümunəleri arasında qələviı komponentlerin miktarı belirgin ölçüde dəyişmiştir.
• Karaciğer və böyrək organ indekslerinin dəyişmemesi kapsamlı toksikolojik güvenlik qanıtı deyil.
• Uzun süreli toksisite, üreme toksisitesi və ya insan güvenliği dəyərlendirilmemiştir.

Tədqiqat ne söylüyor?

• QZTBD’de 221 komponent karakterize edilmiş və ya müvəqqəti olaraq izah edilmişdir.
• Bu komponentlerin yalnız 42’si sıçan serumunda prototip bdaxiliiminde aşkar edilmişdir.
• Prototip serum analizi formüldeki komponentlerin büyük bölməünü kapsamamaktadır.
• Antibiotikle mikrobiota azaltıldığında 19 komponent nəcisda birikmiştir.
• Bu 19 komponentden dokuzunun sinyali gut pasiyentlarından elde edilən mikrobiotayla inkubasiyada azalmıştır.
• Dokuz komponent bağırsaq mikrobiotasıyla əlaqəli dönüşebilir ana komponent adayıdır.
• 15 temsilci komponent eyni LC-MS/MS metodinde ölçülebilmiştir.
• Astilbin, engeletin, quercitrin və proline betaine görece yüksek miktarda aşkar edilmişdir.
• QZTBD gut benzeri sdaxilian modelinde ürik turşu, iltihab, şişlik və ağrı göstergelerini iyiləştirmiştir.
• Mikrobiota azaltıldığında bu etkilərin bir bölməü zəiflamıştır.
• Bağırsaq mikrobiotası karmaşık bitki mənşəli formullerde potensial bioaktiv komponent seçimine dahil ediləbilir.

Tədqiqat ne söylemiyor?

• QZTBD’nin insanlarda klinik olaraq qanıtlanmış bir gut müalicəsi olduğunu göstermemektedir.
• Seçilən 15 komponentin kəsikn aktif maddəler olduğunu qanıtlamamaktadır.
• Mikrobiota tarafından oluşan metabolitlerin kimliklerini göstermemektedir.
• Dokuz ana komponentin azalmasının yalnız biotransformasiyadan mənbəlandığını kəsiknleştirmemektedir.
• Belirli bir bakteri türünün QZTBD etkisinden sualmlu olduğunu göstermemektedir.
• Bağırsaq mikrobiotası olmadan QZTBD’nin tamamen etkisiz olduğunu göstermemektedir.
• Farelerde kullanılan dozların insanlar üçün güvenli və ya uygun olduğunu göstermemektedir.
• Organ indekslerinin dəyişmemesini tam güvenlik garantisi olaraq sunmamaktadır.
• 15 komponentli panelin bütün QZTBD ürünlerinde kalite standardı olduğunu göstermemektedir.
• İnsanlar arasındaki mikrobiota fərqlılıklarına göre kişiselleştirilmiş müalicə önerisi sunmamaktadır.

Tədqiqatnın Metodi və Nəticələrı

Deney gruplarının teknik özeti

Analitik eleme adımlarının sayısal özeti

Şəkillerin temel bilimsel mesajları

Temel nəticələrın düzenli özeti

• UPLC-Q-TOF-MS^E ilə 221 komponent kimyasal sınıflarına ayrılmıştır.
• Kütle hataları ±5 ppm üçünde tutulmuştur.
• Serumda prototip olaraq yalnız 42 komponent aşkar edilmişdir.
• 179 komponent prototip serum analizinin xariciında kalmıştır.
• Antibiotik sonrası nəcisda 19 komponent birikmiştir.
• İnsan gut mikrobiotasıyla inkubasiyada bunların dokuzu azalmıştır.
• 15 temsilci komponent üçün 28 dakikalık LC-MS/MS-MRM metodi kurulmuştur.
• Hedefler 0,013 µg/g’dan 315,430 µg/g’a uzanan geniş miktar aralığını kapsamıştır.
• QZTBD sdaxilianlerde serum sidik turşusu və gut benzeri iltihabi nəticələrı azaltmıştır.
• Antibiotik müdahalesi QZTBD’nin bu etkilərini kısmen zəiflatmıştır.
• Nəticəlar mikrobiota dönüşümünü analitik əvvəlliklendirmeye dahil etmenin uygulanabilir olduğunu göstermiştir.

Mənbə və Metod Notu

Bu daxilierik, Xi Chen, Yi Zhao, Siyue Song, Fei Luo, Xixian Kong, Yu Lou, Ye Xu, Fusen Chen, Yanfang Bai, Kaiyue Shi, Yuqing Wang, Yutong Hua və Tiejuan Shao tarafından hazırlanan “A microbiota-informed UPLC-Q-TOF-MS^E and LC-MS/MS strategy for prioritizing potential bioactive constituents from complex herbal formulas: Application to Qu-Zhuo-Tong-Bi decoction” baş örtüyülı tədqiqatya dayanmaktadır.

Tədqiqat karmaşık bir bitki mənşəli formuldeki potansiyel biyolojik açıdan ilgili komponentleri əvvəlliklendirmek üçün yüksək ayırdetməli kimyəvi profil, sıçan serumu, sıçan nəcissı, antibiotikle mikrobiota azaltma, insan nəcis mikrobiotasıyla in vitro inkubasiya, hədəfli LC-MS/MS nicel analizi və gut benzeri sdaxilian modelini birleştiren deneysel bir preprint araşdırma makalesidir.

Mətnde açıkça “This preprint research paper has not been peer reviewed” uyarısı bulunmaktadır. Dolayısıyla tədqiqat hakem dəyərlendirmesinden gecmemiştir. PDF’de hakemli bir dergi kabulü və ya düzgünlanmış nihai yayın bilgisi mövcud deyil.

Araşdırma bir insan klinik müalicə tədqiqatsı deyil. İnsan iştirakçılardan yalnız nəcis nümunəleri alınmış və bu nümunəlerden elde edilən mikrobiota laboratuvar ortamında QZTBD ilə inkübe edilmiştir. İnsanlarda QZTBD məlumatlmemiş, serum sidik turşusu və ya klinik gut sonucu ölçülmemiştir.

Farmakodinamik nəticəlar yüksək yağlı pəhriz və MSU kristaliyle oluşturulmuş gut benzeri sdaxilian modeline dayanmaktadır. Farelerdeki etkilər insanlarda müalicə başarısı, doz güvenliği və ya klinik etkinlik garantisi olaraq yorumlanmamalıdır.

“Mikrobiota tarafından dönüştürülebilir komponent” ifadesi, ana komponent sinyalinin antibiotik və in vitro inkubasiya müqayisəlarında dəyişmesine dayanmaktadır. Oluşan mikrob metabolitilər yapısal olaraq tanımlanmamıştır.

UPLC-Q-TOF-MS^E ilə açıklanan 221 komponentin bir bölməü referans standartla düzgünlanmış, geri kalanı dəqiq kütlə, fraqmentləşmə nümunəsi, məlumat tabanı və literatür müqayisəsıyla gecici olaraq atanmıştır.

Hedefli LC-MS/MS metodi 15 komponenti eyni tədqiqatda ölçmek üzəre düzgünlanmıştır. Bununla belə her analite ait ayrıntılı düzgünsal aralık, LOQ, RSD və geri qazanım dəyərlerinin tamamı ana metinde yer almamakta; ek tablolara yönlendirilmektedir.

Hayvan deneyleri Zhejiang Chinese Medical University etik kurulu tarafından IACUC-20240219-15 numarasıyla; insan nəcis örneği tədqiqatsı 20240329-6 numarasıyla onaylanmıştır. İştirakçılardan bilgiləndirilmiş onam alındığı qeyd edilmişdir.

Yazarlar çıkar çatışması bulunmadığını bildirmiştir. Tədqiqat National Natural Science Foundation of China, Zhejiang Provincial Natural Science Foundation və Zhejiang Provincial Special Support Program for High-Level Talents tarafından desteklenmiştir.

Bu Türkçe makale yalnız yüklenen PDF’deki deney protokolleri, kromatogramlar, parçalanma şemaları, tablolar, hayvan məlumatleri və yazarların tartımmasına dayanarak hazırlanmıştır. PDF’de bulunmayan klinik müalicə başarısı, kəsikn aktif maddə, düzgünlanmış mikrob metaboliti, insan güvenliği və ya ticari ürün etkinliği iddiası eklenmemiştir.