Fol turşusu (FA), bir-karbon metabolizması, nukleotid sintezi, DNT təmiri və metilləşmə kimi əsas hüceyrə proseslərində iştirak edən B vitamini törəməsidir. Bu preprint tədqiqatında araşdırmaçılar fol turşusunun xroniki alkoqol məruz qalmasının beyin korteksində yaratdığı neyrotoksik təsirləri yalnız antioksidant səviyyədə deyil, həm də protein keyfiyyətinə nəzarət sistemi olan proteostaz və endoplazmatik retikulumun (ER) stress cavabı vasitəsilə təsirləndirib-təsirləndirmədiyini araşdırmışlar. Xroniki alkoqola məruz qoyulan siçanlarda fol turşusu davranış göstəricilərini yaxşılaşdırmış, kortikal histopatoloji zədələnməni, oksidləşdirici stressi və mitoxondri/ER ultrastruktur pozğunluqlarını azaltmışdır. Eyni zamanda HSP90 və GRP78 artımını zəiflətmiş, PERK/ATF4/CHOP stress siqnalını azaltmış və HSP70, HSF1 ilə LAMP2A kimi proteostazla əlaqəli cavabların bir hissəsini yenidən yüksəltmişdir.

PC12 hüceyrələrində aparılan mexanistik təcrübələr etanolun HSP90 protein miqdarını və HSP90 asetilləşməsini artırdığını göstərmişdir. Fol turşusu bu artımları azaltmış; mitoxondri membran potensialını, ATP istehsalını, DNT bütövlüyünü və hüceyrə yaşamasını dəstəkləyən nəticələr vermişdir. HSP90-ın həddindən artıq ekspressiyası fol turşusunun ER stressini zəiflədici təsirini azaldarkən, asetilləşməni artıran trichostatin A tətbiqi fol turşusunun bəzi qoruyucu təsirlərini qismən aradan qaldırmışdır. Molecular docking, CETSA və DARTS nəticələri HSP90-ın fol turşusunun mümkün molekulyar hədəflərindən biri ola biləcəyini dəstəkləyir; lakin birbaşa fiziki bağlanma hələ dəqiq biofiziki üsullarla təsdiqlənməmişdir.

Tədqiqatın əsas problemi

Xroniki və ya həddindən artıq alkoqol istifadəsi öyrənmə, yaddaş və emosional tənzimləmə ilə əlaqəli neyron dövrələrinə mənfi təsir göstərə bilər. Alkoqola məruz qalma mitoxondri funksiyasını poza, ATP istehsalını azalda, reaktiv oksigen növlərinin (ROS) yaranmasını artıra və hüceyrə stress cavablarını aktivləşdirə bilər.

Bu zədələnmənin yalnız oksidləşdirici stresslə izah edilə bilməyəcəyi getdikcə daha çox qəbul edilir. Mitoxondri disfunksiyası, endoplazmatik retikulum stressi, protein keyfiyyətinə nəzarətdə pozulma və metabolik yenidən proqramlaşma bir-birini gücləndirən stress şəbəkəsi yarada bilər.

Bu tədqiqatın yönəldiyi əsas sual budur: Fol turşusu alkoqol mənşəli beyin zədələnməsini HSP90 mərkəzli proteostaz və ER stress mexanizmlərini tənzimləməklə azalda bilərmi?

Proteostaz Nədir və Alkoqol Niyə Bu Sistemi Poza Bilər?

Proteostaz hüceyrənin proteinlərin düzgün qatlanmasını, zədələnmiş proteinlərin təmirini və ya uzaqlaşdırılmasını və protein keyfiyyətinin qorunmasını təmin edən inteqrə olunmuş sistemidir. HSP70, HSP90, HSC70 və LAMP2A kimi proteinlər bu şəbəkənin mühüm komponentlərindəndir.

Uzunmüddətli alkoqol məruz qalması səhv qatlanmış və ya zədələnmiş protein yükünü artıra bilər. Bu halda hüceyrənin şaperon sistemləri üzərində təzyiq yüksəlir. Əgər bu sistemlər tarazlığı bərpa edə bilməzsə, proteotoksik stress ilə ER stressi bir-birini gücləndirə bilər.

HSP90 niyə vacibdir?

Heat Shock Protein 90 (HSP90), çoxsaylı müştəri proteinlərin qatlanması və stabilliyində iştirak edən ATP-asılı molekulyar şaperondur.

HSP90 aktivliyi yalnız protein miqdarı ilə deyil, asetilləşmə kimi post-translational modifikasiyalarla da tənzimlənə bilər. Həddindən artıq və ya uyğunsuz HSP90 aktivliyi hüceyrənin normal stress adaptasiyasından maladaptiv proteostaz vəziyyətinə keçidinin bir hissəsi ola bilər.

Tədqiqatda xroniki alkoqol məruz qalması HSP90 protein səviyyəsini artırmış, lakin Hsp90 mRNA səviyyəsi nəzərəçarpacaq dərəcədə dəyişməmişdir. Bu nəticə HSP90 artımının ən azı qismən transkripsiyadan sonrakı və ya protein stabilliyi səviyyəsindəki mexanizmlərlə əlaqəli ola biləcəyini düşündürür.

Fol Turşusu HSP90-a Birbaşa Bağlanırmı?

Tədqiqat HSP90-ı əvvəlcə şəbəkə farmakologiyası yanaşması ilə mümkün hədəf kimi müəyyən etmişdir. Fol turşusunun proqnozlaşdırılan hədəfləri ilə alkoqolla əlaqəli beyin zədələnməsi genləri arasında 30 ortaq gen müəyyən edilmiş və HSP90 şəbəkənin mərkəzi düyünlərindən biri kimi önə çıxmışdır.

Molekulyar docking analizində fol turşusu ilə HSP90 arasında təxminən −8,6 kcal/mol bağlanma enerjisi hesablanmış; LEU93, ASN37, SER38 və ASP39 bölgələri ilə qarşılıqlı təsir proqnozlaşdırılmışdır.

Docking təkbaşına fiziki bağlanmanın eksperimental sübutu deyil. Buna görə araşdırmaçılar əlavə olaraq iki hüceyrəvi hədəf–qarşılıqlı təsir testindən istifadə etmişlər.

CETSA təcrübəsində fol turşusunun iştirakı ilə HSP90-ın termal stabilliyinin artdığı müşahidə edilmişdir. DARTS təcrübəsində isə HSP90-ın proteaz həzminə qarşı daha davamlı hala gəldiyi bildirilmişdir.

Bu məlumatlar fol turşusu ilə HSP90 arasında qarşılıqlı təsir ola biləcəyini dəstəkləyir. Lakin müəlliflər birbaşa bağlanmanın daha qabaqcıl biofiziki üsullarla təsdiqlənməli olduğunu açıq şəkildə bildirirlər.

Heyvan modeli necə quruldu?

Səkkiz həftəlik erkək C57BL/6J siçanları beş qrupa bölünmüşdür:

• Nəzarət
• Alkoqol modeli
• Fol turşusu
• 4-PBA
• 17-AAG

Hər qrupda 20 siçan olmuşdur.

Nəzarət qrupu alkoqolsuz izokalorik Lieber-DeCarli pəhrizi alarkən digər qruplar %4 v/v alkoqol ehtiva edən Lieber-DeCarli maye pəhrizindən istifadə etmişdir.

Fol turşusu:

5 mg/kg/gün, həftədə altı gün, ümumilikdə 12 həftə oral qavaj yolu ilə verilmişdir.

ER stressini hədəfləyən 4-PBA və HSP90 inhibitoru 17-AAG isə xroniki alkoqol məruz qalması yaradıldıqdan sonra son üç həftədə tətbiq edilmişdir.

Davranış testlərində nə müşahidə edildi?

Alkoqola məruz qalma elevated plus maze və Y-maze testlərində tədqiqatçı davranışları azaltmış, forced swimming testində isə hərəkətsizlik davranışını artırmışdır.

Fol turşusu qəbul edən siçanlarda bu davranış dəyişikliklərinin mühüm hissəsi yüngülləşmişdir. Oxşar istiqamətdə yaxşılaşmalar 4-PBA və 17-AAG qruplarında da müşahidə edilmişdir.

Bu oxşarlıq ER stressi və HSP90-la əlaqəli proseslərin alkoqol mənşəli davranış pozğunluqlarının altında yatan mexanizmin hissələrindən biri ola biləcəyi şərhini dəstəkləyir.

Kortikal toxuma zədələnməsi

H&E boyaması alkoqol qrupunda neyron təşkilatlanmasının pozulmasını və vakuolyar degenerasiyanı göstərmişdir. Nissl boyamasında Nissl cisimciklərinin sıxlığı azalmışdır.

Fol turşusu tətbiqindən sonra neyron düzülüşü daha nizamlı olmuş, vakuolizasiya azalmış və Nissl sıxlığı alkoqol modelinə nisbətən artmışdır.

Alkoqol Mitoxondri və Endoplazmatik Retikuluma Necə Təsir Etdi?

Alkoqola məruz qalan siçanların korteksində antioksidant ferment aktivlikləri azalmış, ROS səviyyəsi artmışdır.

Transmissiya elektron mikroskopiyası:

• mitoxondri şişməsi,
• mitoxondri kristalarının pozulması,
• endoplazmatik retikulumun genişlənməsi

kimi ultrastruktur zədələnmələri göstərmişdir.

Fol turşusu bu struktur dəyişikliklərinin şiddətini azaltmışdır.

HSP90 və GRP78 niyə birlikdə artdı?

İmmunoflüoresan müayinələrdə alkoqola məruz qalmadan sonra kortikal hüceyrələrdə həm HSP90, həm də ER stress şaperonu GRP78 artmış və iki proteinin ko-lokalizasiyası güclənmişdir.

Bu tapıntı hüceyrənin protein keyfiyyətinə nəzarət sistemi ilə ER stress cavabının eyni vaxtda aktivləşdiyini göstərir.

Fol turşusu həm HSP90, həm də GRP78 səviyyələrini azaltmışdır.

PERK–ATF4–CHOP Yolu Nədir?

PERK, endoplazmatik retikulumda protein qatlanma stressi yarandıqda aktivləşə bilən üç əsas unfolded protein response sensorundan biridir.

Uzunmüddətli və ya aradan qaldırılmayan ER stressində PERK siqnalı ATF4 və CHOP vasitəsilə hüceyrə ölümünə töhfə verə bilər.

Alkoqol qrupunda:

• GRP78 ↑
• p-PERK ↑
• ATF4 ↑
• CHOP ↑

aşkar edilmişdir.

Fol turşusu bu artımları nəzərəçarpacaq dərəcədə azaltmışdır.

Bu nəticə fol turşusunun alkoqol mənşəli maladaptiv ER stressini zəiflətdiyi şərhini dəstəkləyir.

Proteostazla əlaqəli digər proteinlər

Alkoqola məruz qalmadan sonra HSP70 və HSF1 səviyyələri azalmış, LAMP2A siqnalı zəifləmişdir.

Fol turşusu tətbiqi:

• HSP70-i artırmış,
• HSF1 cavabını qismən bərpa etmiş,
• LAMP2A səviyyəsini yüksəltmişdir.

Bu dəyişikliklər protein keyfiyyətinə nəzarət qabiliyyətində qismən bərpa ilə uyğundur.

LAMP2A və HSC70 Niyə Vacibdir?

LAMP2A və HSC70, şaperon vasitəli autofagiya (Chaperone-Mediated Autophagy, CMA) sisteminin əsas komponentlərindəndir.

CMA müəyyən sitozolik proteinlərin lizozoma seçici şəkildə daşınaraq parçalanmasını təmin edir.

Tədqiqatda etanol məruz qalması LAMP2A və HSC70 proteinlərini azaldarkən, fol turşusu bu proteinlərin səviyyəsini yüksəltmişdir.

Lakin araşdırmaçılar CMA aktivliyini birbaşa axın ölçümü ilə qiymətləndirməmişlər. Buna görə nəticələr “CMA qəti şəkildə aktivləşdirildi” kimi şərh edilə bilməz.

Metabolomik analiz

Kortikal toxumada UPLC-Q-TOF əsaslı hədəfsiz metabolomik analiz aparılmışdır.

Nəzarət və alkoqol modeli arasında 26, fol turşusu ilə alkoqol modeli arasında isə 31 diferensial metabolit müəyyən edilmişdir.

Volcano plot analizində alkoqol qrupunda 90 metabolitin artdığı, 41 metabolitin azaldığı; fol turşusundan sonra isə 10 metabolitin artdığı və 31 metabolitin azaldığı bildirilmişdir.

Ən nəzərəçarpacaq dəyişikliklərin:

• triptofan–kinurenin metabolizması,
• şaxələnmiş zəncirli amin turşusu metabolizması

ilə əlaqəli olduğu görülmüşdür.

Kinurenin Yolu ilə ER Stressi Arasında Əlaqə Varmı?

Triptofan–kinurenin yolu iltihab, oksidləşdirici stress və neyroaktiv metabolit istehsalı ilə əlaqəlidir.

PC12 hüceyrələrində etanol:

• IDO1 proteinini artırmış,
• kinurenin yığılmasını artırmışdır.

Fol turşusu bu dəyişiklikləri qismən azaltmışdır.

4-PBA-nın oxşar istiqamətdə təsir göstərməsi ER stressinin bu metabolik dəyişikliklərlə əlaqəli ola biləcəyini düşündürür.

Lakin ATF4 və ya IDO1 birbaşa susdurulmadığı və ya həddindən artıq ekspressiya edilmədiyi üçün PERK/ATF4 → IDO1 → kinurenin zəncirinin səbəb-nəticə əlaqəsi hələ qəti deyil.

PC12 hüceyrələrində etanol zədələnməsi

PC12 hüceyrələrində 500 mM etanol istifadə edilmişdir.

Bu məruz qalma:

• hüceyrə canlılığını azaltmış,
• ROS-u artırmış,
• mitoxondri membran potensialını azaltmış,
• ATP istehsalını azaltmış,
• comet assay ilə DNT zədələnməsini artırmış,
• γ-H2AX siqnalını yüksəltmişdir.

Fol turşusu üçün 20 və 40 µM dozaları sonrakı təcrübələrdə istifadə edilmiş və bu dozalar etanolun yaratdığı hüceyrə zədələnməsinin mühüm hissəsini azaltmışdır.

HSP90-ın Həddindən Artıq Ekspressiyası Fol Turşusunun Təsirini Dəyişdirdimi?

Bəli. HSP90-ın həddindən artıq ekspressiya edildiyi PC12 hüceyrələrində fol turşusunun HSP90, GRP78, p-PERK, ATF4 və CHOP üzərindəki zəiflədici təsirləri azalmışdır.

Bu nəticə HSP90-ın yalnız alkoqol stressi zamanı artan bir marker olmadığını, həm də fol turşusunun qoruyucu təsirlərinin meydana çıxmasında funksional rol oynaya biləcəyini dəstəkləyir.

HSP90 inhibitoru 17-AAG isə bir çox ölçüdə fol turşusuna oxşar istiqamətdə nəticələr vermişdir.

HSP90 Asetilləşməsi Niyə Kritikdir?

HSP90 funksiyası asetilləşmə ilə tənzimlənə bilər. Asetilləşmiş HSP90-ın konformasiyası və şaperon aktivliyi dəyişə bilər.

Tədqiqatda etanol:

Ac-HSP90 ↑

yaratmışdır.

Fol turşusu isə HSP90 asetilləşməsini azaltmışdır.

Asetilləşməyə təsir edən histon deasetilaza inhibitoru trichostatin A (TSA) əlavə edildikdə fol turşusunun Ac-HSP90-u azaltma təsiri zəifləmişdir.

TSA eyni zamanda fol turşusunun:

• PERK/ATF4/CHOP siqnalını zəiflətmə,
• LAMP2A və HSC70-i artırma,
• apoptozu azaltma

təsirlərinin bir hissəsini geri çevirmişdir.

Apoptoz nəticələri

Etanol məruz qalması:

• apoptotik hüceyrə nisbətini artırmış,
• Bax səviyyəsini artırmış,
• cleaved caspase-3 səviyyəsini artırmış,
• Bcl-2 səviyyəsini azaltmışdır.

Fol turşusu bu dəyişikliklərin çoxuna əks istiqamətdə təsir göstərmişdir.

TSA tətbiqi qoruyucu təsirin bir hissəsini azaltmışdır.

İnsan AUD Beyin Məlumatı Nə Göstərdi?

Araşdırmaçılar GSE182173 məlumat dəstindəki insan prefrontal korteks transkriptomunu yenidən analiz etmişlər.

Gene Set Enrichment Analysis nəticələrinə görə:

• neuronal ensheathment: Nəzarət istiqamətində, NES = 2,380
• oligodendrocyte differentiation: Nəzarət istiqamətində, NES = 2,254
• lysosome organization: Nəzarət istiqamətində, NES = 1,693
• KEAP1–NRF2 signaling: AUD istiqamətində, NES = −1,897

aşkar edilmişdir.

AUD qrupunda miyelinlə əlaqəli PLP1 və MAG ekspressiyası daha aşağı, oksidləşdirici stresslə əlaqəli GSTM1 və NQO1 isə daha yüksək olmuşdur.

Bu nəticələr AUD prefrontal korteksində miyelin/oliqodendrosit proqramlarının, lizozomal homeostazın və oksidləşdirici stress cavablarının dəyişdiyini göstərir.

Bu İnsan Məlumatı HSP90 Mexanizmini Sübut Edirmi?

Xeyr. GSE182173 analizi yalnız AUD olan insanların beyin toxumasındakı transkripsional yol dəyişikliklərini göstərir.

Məlumat dəstində fol turşusu müalicəsi tətbiq edilməmiş, HSP90–fol turşusu qarşılıqlı təsiri eksperimental olaraq sınaqdan keçirilməmişdir.

Beləliklə insan transkriptom məlumatı HSP90 mərkəzli mexanizmi birbaşa təsdiqləmir; yalnız eksperimental modeldə müşahidə edilən stress, lizozom və hüceyrə homeostazı dəyişiklikləri üçün klinik kontekst təqdim edir.

Tədqiqatın Metodu və Nəticələri

Eksperimental dizaynın xülasəsi

Təklif olunan mexanizm

Tədqiqatın birbaşa dəstəklədiyi nəticələr

• Fol turşusu xroniki alkoqola məruz qalan siçanlarda davranış və kortikal histopatologiya nəticələrini yaxşılaşdırmışdır.
• Fol turşusu oksidləşdirici stressi, mitoxondri və ER zədələnməsini azaltmışdır.
• Alkoqol HSP90 proteinini artırdığı halda HSP90 mRNA-sında nəzərəçarpacaq artım yaratmamışdır.
• Fol turşusu HSP90 və GRP78 artımını azaltmışdır.
• Fol turşusu PERK/ATF4/CHOP siqnalını zəiflətmişdir.
• HSP90-ın həddindən artıq ekspressiyası fol turşusunun ER stressini zəiflədici təsirini azaltmışdır.
• Fol turşusu HSP90 asetilləşməsini azaltmışdır.
• TSA fol turşusunun HSP90 asetilləşməsi və bəzi proteostaz/apoptoz nəticələri üzərindəki təsirini zəiflətmişdir.
• Fol turşusu PC12 hüceyrələrində etanol mənşəli mitoxondri disfunksiyasını və DNT zədələnməsini azaltmışdır.
• Fol turşusu triptofan–kinurenin metabolizmasındakı bəzi alkoqol mənşəli dəyişiklikləri qismən düzəltmişdir.

Tədqiqatın birbaşa sübut etmədiyi məqamlar

• Fol turşusunun insanlarda alkoqol istifadəsi pozuntusunu müalicə etdiyi göstərilməmişdir.
• Fol turşusu ilə HSP90 arasında birbaşa fiziki bağlanma qəti şəkildə sübut edilməmişdir.
• HSP90-ın hansı asetilləşmə sahəsinin kritik olduğu müəyyən edilməmişdir.
• Əlaqəli deasetilaza fermenti müəyyən edilməmişdir.
• Şaperon vasitəli autofagiya axını birbaşa ölçülməmişdir.
• PERK/ATF4–IDO1–kinurenin zəncirinin səbəbiyyət əlaqəsi birbaşa genetik müdaxilə ilə göstərilməmişdir.
• İnsan GSE182173 məlumatı fol turşusu müalicəsini və ya HSP90 mexanizmini birbaşa sınaqdan keçirmir.

Klinik baxımdan necə şərh edilməlidir?

Tədqiqatın nəticələri fol turşusunun alkoqol mənşəli sinir hüceyrəsi stressində bioloji baxımdan əhəmiyyətli qoruyucu mexanizmlərə malik ola biləcəyini düşündürür.

Bununla belə, istifadə edilən fol turşusu dozası siçan modelinə xasdır və birbaşa insana çevrilə bilməz. Klinik effektivlik, təhlükəsizlik, doza və müalicə müddəti nəzarətli insan tədqiqatlarında müəyyən edilmədən bu nəticələr müalicə tövsiyəsi kimi şərh edilməməlidir.

Mənbə və Metod Qeydi

Orijinal tədqiqat: Folic acid attenuates alcohol-induced neurotoxicity by modulating HSP90-associated proteostasis and endoplasmic reticulum stress.

Müəlliflər: Nan Zhang, Kening Zhang, Huaqi Zhang, Bingxue Song, Xi Liang, Zhitong Zhou, Meilan Xue və Hui Liang.

Qurumlar: Qingdao Medical College, Qingdao University; Department of Cardiovascular Medicine, Qingdao University Affiliated Hospital; Science Center for Future Foods, Jiangnan University.

Nəşr statusu: SSRN preprint. Həmkar rəyindən keçməmişdir.

SSRN: 7346567.

Heyvan modeli: Erkək C57BL/6J siçanları; %4 v/v etanol ehtiva edən Lieber-DeCarli pəhrizi; 12 həftəlik xroniki məruz qalma.

Fol turşusu tətbiqi: 5 mg/kg, oral qavaj, gündə bir dəfə, həftədə altı gün.

Hüceyrə modeli: PC12 hüceyrələri, 500 mM etanol; fol turşusu 20 və 40 µM.

Əsas metodlar: davranış testləri, H&E, Nissl, TEM, ROS analizi, Western blot, qRT-PCR, immunoflüoresan, comet assay, JC-1, immunoprecipitation, network pharmacology, molecular docking, CETSA, DARTS, hədəfsiz metabolomika və insan transkriptomunun yenidən analizi.

Statistika: One-way ANOVA + Tukey və ya Kruskal-Wallis + Dunn; Spearman korrelyasiyası; çoxsaylı müqayisələrdə Benjamini-Krieger-Yekutieli düzəlişi; q < 0,05 əhəmiyyətli qəbul edilmişdir.

Maliyyələşdirmə: National Natural Science Foundation of China No. 82273626; Shandong Province Natural Science Foundation No. ZR2024MH073; Qingdao Key Technology Research and Industrialization Demonstration Projects No. 25-1-1-gjgg-71-nsh.

Məlumatların əlçatanlığı: Məlumatların sorğu əsasında təqdim ediləcəyi bildirilmişdir.

Maraqlar toqquşması: Müəlliflər maraqlar toqquşmasının olmadığını bəyan etmişlər.

Əsas məhdudiyyətlər: Tədqiqat preprintdir. Fol turşusu-HSP90 fiziki bağlanması dəqiq biofiziki üsullarla təsdiqlənməmişdir. HSP90 asetilləşmə sahələri və əlaqəli deasetilazalar müəyyən edilməmişdir. CMA axını birbaşa ölçülməmişdir. İnsan transkriptom analizi ikincili və yol səviyyəsindədir; fol turşusu müalicəsini sınaqdan keçirmir.