Bu tədqiqatda 4-xlorofenoksisirkə turşusunun (4-CPA) suda sürətli və kəmiyyətcə təyini üçün homogen flüoresans polarizasiya immunoassayı (FPIA) hazırlanmışdır. Tədqiqatçılar M1 monoklonal anticismini iki fərqli flüoresan 4-CPA izləyicisi ilə müqayisə etdilər; qısa bağlayıcı daşıyan 4-CPA-EDF izləyicisi ilə 15 dəqiqəlik analizdə 1,2 ng/mL aşkarlama həddi və təxminən 2,3–300 ng/mL analitik diapazon əldə edildi. 4-CPA əlavə edilmiş real açıq-su nümunələrində Cədvəl 4-ə görə bərpa %98–110 arasında olmuşdur. Metodun əsas məhdudiyyəti struktur baxımından oxşar 2,4-D-yə qarşı %48 çarpaz reaktivlik göstərməsi idi; tədqiqatçılar bunu riyazi ikili-FPIA təhlili və 2,4-D-nin afinlik kolonu ilə əvvəlcədən uzaqlaşdırılması olmaqla iki üsulla həll etməyə çalışdılar. İkili-FPIA düzəlişi sınaqdan keçirilən qarışıqlarda %116–151 bərpa ilə aydın həddindən artıq qiymətləndirmə yaratdığı halda, afinlik kolonlu yanaşma sınaqdan keçirilən şərtlərdə 4-CPA üçün təxminən %103,6–110 bərpa təmin etdi.

4-CPA bitkilərdə oksinəbənzər təsir göstərə bilən sintetik fenoksisirkə turşusu törəməsidir. Kənd təsərrüfatı tətbiqlərində bitki böyümə tənzimləyicisi kimi istifadə oluna bildiyi kimi, yüksək dozalarda herbisid təsiri də göstərə bilər. Buna görə su və kənd təsərrüfatı nümunələrində qalıqlarının sürətlə izlənməsi analitik baxımdan əhəmiyyətlidir. Tədqiqatın məqsədi yüksək avadanlıq tələb edən xromatoqrafik metodları əvəz edəcək universal istinad üsulu hazırlamaq deyil; sürətli, homogen və daşına bilən ölçməyə uyğun immunokimyəvi skrininq yanaşması yaratmaqdır.

Tədqiqatın mühüm yeniliklərindən biri yalnız 4-CPA üçün FPIA qurulması deyil, immunoassaylarda tez-tez rast gəlinən struktur oxşarlığı probleminə birbaşa həll axtarılmasıdır. M1 anticismi 4-CPA-nı güclü şəkildə tanıdığı halda 2,4-D-yə qarşı da mühüm cavab verdi. Buna qarşılıq ayrıca anti-2,4-D anticismi tədqiqatçıların sınaq şərtlərində 4-CPA-ya mənalı çarpaz cavab göstərmədi. Bu asimmetriya həm iki testdən alınan nəticələrin riyazi şəkildə ayrılmasında, həm də 2,4-D-nin nümunədən fiziki olaraq tutulub uzaqlaşdırılmasında istifadə edildi.

Tədqiqatın əsas problemi nədir?

4-CPA kimi aşağı molekulyar kütləli kənd təsərrüfatı kimyəvilərinin təyinində əsas analitik problem yalnız aşağı konsentrasiyaları ölçə bilmək deyil. Eyni zamanda hədəf molekulu çox oxşar kimyəvi quruluşa malik digər birləşmələrdən fərqləndirmək lazımdır. Xüsusilə 4-CPA ilə geniş istifadə olunan fenoksi herbisid 2,4-D arasındakı struktur oxşarlığı anticisim əsaslı analizlərdə çarpaz reaktivlik yarada bilər.

Tədqiqatda bu problem iki mərhələdə həll edildi. Birinci məqsəd 4-CPA üçün kifayət qədər həssas və sürətli FPIA qurmaq idi. İkinci məqsəd isə FPIA-nın 2,4-D-yə verdiyi çarpaz cavabı idarə edə biləcək analitik strategiyalar hazırlamaq idi.

Flüoresans polarizasiya immunoassayı necə işləyir?

Flüoresans polarizasiya immunoassayı məhluldakı flüoresan işarəli kiçik molekulların fırlanma hərəkətlərindəki dəyişiklikləri ölçür. Sərbəst vəziyyətdəki kiçik flüoresan izləyici sürətlə fırlanır və həyəcanlandırılmış işığın polarizasiyasını daha çox itirir. Eyni izləyici böyük bir anticismə bağlandıqda bütün kompleks daha yavaş fırlanır; buna görə yayılan flüoresansın polarizasiyası daha yüksək qalır.

4-CPA kimi kiçik bir hədəf molekul nümunədə olduqda, flüoresan işarəli 4-CPA izləyicisi ilə anticismin bağlanma sahəsi üçün rəqabət aparır. Nümunədəki sərbəst 4-CPA artdıqca anticismə bağlı flüoresan izləyicinin miqdarı azalır və ölçülən polarizasiya siqnalı aşağı düşür. Beləliklə, 4-CPA konsentrasiyası ilə flüoresans polarizasiyası arasında kalibrləməyə əsaslanan kəmiyyət əlaqəsi qurula bilər.

Bu yanaşmanın tədqiqat baxımından mühüm tərəfi ənənəvi heterogen immunoassaylarda görülən çoxsaylı yuma və ayırma mərhələlərinə ehtiyac olmadan “qarışdır, inkubasiya et və ölç” məntiqi ilə işləyə bilməsidir.

M1 anticisminin mənşəyi niyə diqqətəlayiqdir?

Mənbədə mühüm biblioqrafik/metodoloji uyğunsuzluq var. Xülasə bölməsində M1 anticismi 4-CPA-ya qarşı yaradılmış bir anticisim kimi təsvir edilir. Buna qarşılıq metod bölməsində immunogen hazırlanarkən 2,4-D-dən istifadə edildiyi açıq şəkildə göstərilir və nəticələrdə M1-in 2,4-D-yə qarşı hazırlanmış hibridoma klonlarının skrininqi zamanı ortaya çıxdığı izah edilir.

Nəticə bölməsinə görə M1-in gözlənilməz xüsusiyyəti, bağlanması hədəflənən 2,4-D-dən daha çox 4-CPA-ya yüksək afinlik göstərməsidir. ELISA əsaslı müqayisədə M1 üçün IC50 dəyəri 4-CPA ilə 0,71 µg/mL, 2,4-D ilə 2,22 µg/mL olaraq bildirildi. Ayrı anti-2,4-D anticismi üçün 2,4-D IC50 dəyəri 0,70 µg/mL olduğu halda 4-CPA-ya çarpaz reaktivlik təcrübənin aşkarlama hədləri daxilində müşahidə edilmədi.

Buna görə M1-i “başlanğıcdan 4-CPA üçün hazırlanmış yüksək spesifik anticisim” kimi təsvir etmək mənbə ilə tam uyğun deyil. Daha düzgün ifadə, onun 2,4-D-yə yönəlmiş hibridoma tədqiqatında ortaya çıxan və 4-CPA-ya gözlənilmədən yüksək afinlik göstərən bir klon olmasıdır.

Niyə iki flüoresan izləyici sintez edildi?

FPIA həssaslığı yalnız anticismin afinliyindən deyil, flüoresan işarəli antigen analoqunun quruluşundan da asılıdır. Buna görə tədqiqatçılar 4-CPA-nı iki fərqli flüoresan törəməsinə bağladılar:

• 4-CPA-EDF: 4-CPA ilə flüoresan quruluş arasında iki CH2 qrupu olan daha qısa bağlayıcı.
• 4-CPA-6-AHF: altı CH2 qrupu olan daha uzun bağlayıcı.

4-CPA-nın karboksil qrupu DCC/NHS əsaslı karbodiimid kimyası ilə aktivləşdirildi və flüoresan törəmələrin amin qrupları ilə amid bağı yaradıldı. İzləyicilər nazik təbəqə xromatoqrafiyası ilə təmizləndi. Tədqiqatda sintez çıxımının başlanğıc flüoresanına nisbətən tipik olaraq təxminən %30–40 olduğu bildirildi.

İzləyicilərin həqiqətən sintez edildiyi necə təsdiqləndi?

Yalnız flüoresan siqnalın alınması quruluşun düzgün olduğunu sübut etmək üçün kifayət hesab edilmədi. Tədqiqatçılar 4-CPA-EDF və 4-CPA-6-AHF məhsullarını yüksək performanslı maye xromatoqrafiyası-yüksək ayırdetməli kütlə spektrometriyası (HPLC-HRMS) ilə analiz etdilər.

4-CPA-EDF üçün deprotonlaşdırılmış molekul ionu [M−H]⁻ m/z 616,0942; 4-CPA-6-AHF üçün m/z 641,1696 olaraq ölçüldü. Bildirilən kütlə xətaları müvafiq olaraq −1,6 ppm və 0,01 ppm səviyyəsində idi. Eksperimental izotop paylanmaları hesablanmış molekulyar formullarla uyğun gəldi.

MS/MS parçalanma analizində hər iki izləyicidə 4-CPA qalığını dəstəkləyən təxminən m/z 126,994 xarakterik fraqment görüldü. Flüoresan nüvəni və bağlayıcı bölgələri təmsil edən tamamlayıcı fraqmentlərin də olması tədqiqatçıların 4-CPA-nın flüoresan daşıyıcıya kovalent şəkildə bağlandığı nəticəsini dəstəklədi.

İzləyici konsentrasiyası necə optimallaşdırıldı?

İki izləyicinin flüoresans intensivliyi və polarizasiyası müxtəlif konsentrasiyalarda ölçüldü. Aşağı konsentrasiyalarda siqnal/küy nisbəti zəifləyərkən, təxminən 1–10 nM aralığında flüoresans intensivliyi istifadə edilə biləcək səviyyədə artır və polarizasiya nisbətən sabit qalırdı. 10 nM-dən yuxarı konsentrasiyalarda isə xətti davranışın pozulduğu və polarizasiyada dəyişiklik müşahidə edildiyi bildirildi.

Buna görə tədqiqat üçün 5 nM işçi məhlul seçildi; qarışdırmadan sonra kalibrləmə təcrübələrində yekun izləyici konsentrasiyası təxminən 2,5 nM olaraq bildirildi.

Anticisim-izləyici bağlanması nə göstərdi?

M1 anticisminin iki izləyiciyə bağlanması qeyri-spesifik M2 monoklonal anticismi ilə müqayisə edildi. M1 əlavə edildikdə aşağı anticisim konsentrasiyalarından başlayaraq bağlı fraksiya və flüoresans polarizasiyasında sürətli artım görüldüyü halda M2 mənalı siqnal dəyişikliyi yaratmadı.

M1 üçün təxminən %50 bağlı fraksiyaya uyğun gələn yekun konsentrasiyalar 4-CPA-EDF ilə 2,2 ± 0,1 nM və 4-CPA-6-AHF ilə 3,2 ± 0,3 nM olaraq müəyyən edildi.

Hansı izləyici daha yaxşı analitik performans göstərdi?

İki izləyicinin 4-CPA təyinində analitik performansı birbaşa müqayisə edildikdə qısa bağlayıcılı 4-CPA-EDF daha aşağı aşkarlama həddi verdi.

Bu nəticə bağlayıcı uzunluğu ilə həssaslıq arasında sadə “uzun bağlayıcı daha yaxşıdır” əlaqəsinin olmadığını göstərir. Tədqiqatçılar fərqi flüoroforun yerli hərəkətliliyi, anticismə əlçatanlıq, sterik təsirlər və fırlanma hərəkətinin bağlanmadan sonra nə dərəcədə məhdudlaşması kimi bir neçə amillə müzakirə edirlər.

Mənbənin öz məlumatlarına görə ən həssas kombinasiya 4-CPA-EDF/M1 olmuşdur. Bununla belə, bildirilen 1,2 ± 1,2 ng/mL LOD dəyərindəki qeyri-müəyyənliyin mərkəzi dəyər qədər böyük olması da analitik performansın şərhində nəzərə alınmalıdır.

Analiz niyə 15 dəqiqə çəkir?

Anticisim və flüoresan izləyicinin bağlanma kinetikası araşdırıldıqda tarazlığa təxminən 15 dəqiqədə çatıldığı, bundan sonra flüoresans polarizasiya siqnalının təxminən 60 dəqiqə ərzində qorunduğu bildirildi. Buna görə rutin ölçmə vaxtı 15 dəqiqə seçildi.

Ölçmələrdə daşına bilən Sentry 200 flüorimetri istifadə edildi. Tədqiqatda həyəcanlandırma dalğa uzunluğu 485 nm, emissiya dalğa uzunluğu 535 nm olaraq verildi. Təcrübələr 25 °C-də və pH 8,5 borat tamponunda aparıldı.

4-CPA üçün əldə edilən əsas performans nədir?

4-CPA-EDF/M1 kombinasiyası ilə hazırlanmış FPIA üçün bildirilən aşkarlama həddi 1,2 ng/mL, IC20–IC80 əsaslı təyin diapazonu təxminən 2,3–300 ng/mL və ölçmə müddəti 15 dəqiqədir. Kalibrləmə qrafikinin yarımloqarifmik xətti göstərilişi üçün tədqiqat Y = (0,91 ± 0,02) − (0,24 ± 0,01) × X və R² = 0,98 dəyərlərini bildirir.

Seçicilikdə əsas problem: 2,4-D

FPIA-nın seçiciliyi struktur baxımından oxşar fenoksi birləşmələri, həmçinin qlifosat, atrazin və xlorpirifosa qarşı sınaqdan keçirildi. 4-CPA istinad olaraq %100 qəbul edildikdə 2,4-D üçün %48 çarpaz reaktivlik tapıldı. 2,4,5-T üçün %25, MCPA üçün %6 və 3,4-D üçün %0,2 dəyərləri bildirildi. Qlifosat, atrazin və xlorpirifos üçün çarpaz reaktivlik %0,1-dən aşağı qaldı.

Bu məlumat metod baxımından kritik bir nöqtəni göstərir: FPIA 4-CPA-nı həssas şəkildə aşkar etsə də, nümunədə 2,4-D olduqda ölçülən siqnalın yalnız 4-CPA-dan qaynaqlandığı fərz edilə bilməz.

Real su matrisi təcrübəsi nə göstərdi?

Tədqiqatçılar xlorofenoksisirkə turşuları baxımından əvvəlcədən HPLC ilə yoxlanılmış açıq-su nümunələrinə məlum miqdarlarda 4-CPA əlavə edərək recovery testi apardılar. Nəticə cədvəlində dörd konsentrasiya bildirildi:

Cədvələ görə real açıq-su matrisində müşahidə edilən bərpa diapazonu %98–110-dur. Xülasə və nəticə bölmələrində %98–112 ifadəsi istifadə edildiyinə görə mənbədə kiçik ədədi uyğunsuzluq var; Verianla mətnində birbaşa eksperimental cədvəldəki dəyərlər əsas götürülmüşdür.

2,4-D müdaxiləsi üçün birinci həll: iki FPIA-dan birlikdə istifadə etmək

Birinci həll yolunda eyni nümunə həm 4-CPA FPIA, həm də daha əvvəl hazırlanmış 2,4-D FPIA ilə ölçüldü. Məntiq 4-CPA sisteminin 2,4-D-yə %48 cavab verməsi, buna qarşılıq istifadə olunan 2,4-D sisteminin 4-CPA-ya praktik olaraq çarpaz cavab verməməsi fərziyyəsinə əsaslanır.

Mənbədə bu əlaqə aşağıdakı tənlik sistemi ilə ifadə edilir:

\[ C_1 = X \times A + Y \times 0.48 \times A \]

\[ C_2 = X \times 0 \times B + Y \times B \]

Burada X real 4-CPA konsentrasiyasını, Y real 2,4-D konsentrasiyasını, A 4-CPA test sisteminin vahid 4-CPA cavabını, B 2,4-D test sisteminin vahid 2,4-D cavabını, C1 4-CPA sistemi ilə və C2 2,4-D sistemi ilə ölçülən ümumi cavabı təmsil edir.

Normallaşdırmadan sonra tədqiqat əlaqəni:

\[ D_1 = X + 0.48Y \]

\[ D_2 \approx Y \]

şəklində sadələşdirir.

Lakin eksperimental nəticələr riyazi yanaşmanın sınaqdan keçirilən qarışıqlarda mühüm müsbət qərəz yaratdığını göstərir:

Buna görə ikili-FPIA yanaşmasının konseptual olaraq iki analiti ayıra bildiyi göstərilsə də, Cədvəl 5-dəki nəticələr xüsusilə daha yüksək konsentrasiyalarda 4-CPA-nın əhəmiyyətli dərəcədə artıq hesablandığını göstərir. Mənbə mətnindəki “düzgün təyin” qiymətləndirməsi bu rəqəmlərlə birlikdə ehtiyatla oxunmalıdır.

İkinci həll: 2,4-D-ni ölçmədən əvvəl fiziki olaraq uzaqlaşdırmaq

İkinci strategiyada tədqiqatçılar 2,4-D-yə spesifik anticisimləri BrCN ilə aktivləşdirilmiş Sepharose 4B üzərinə immobilizə edərək afinlik kolonu yaratdılar. Nümunə bu kolondan keçirildikdə 2,4-D-nin kolonda tutulması, 4-CPA-nın isə sonrakı FPIA üçün məhlulda qalması hədəfləndi.

Yalnız 2,4-D olan nümunələr kolondan keçirildikdən sonra 4-CPA FPIA siqnalında 2,4-D müdaxiləsini düşündürəcək aydın fərq müşahidə edilmədi. Tədqiqatçılar bunu sınaqdan keçirilən şərtlərdə 2,4-D-nin kolonda adsorbsiya edilməsi ilə izah etdilər.

Daha sonra 2,4-D və 4-CPA-nın birlikdə olduğu nümunələr sınaqdan keçirildi. Kolon və nümunə seyreltməsindən sonra Cədvəl 6-da 30 ng/mL 2,4-D mövcudluğunda aşağıdakı nəticələr verildi:

Bu təcrübə seriyasında afinlik kolonlu yanaşma ikili-FPIA riyazi düzəlişindən daha balanslı bərpa dəyərləri verdi. Lakin bu nəticə müəyyən laboratoriya şərtlərinə, istifadə olunan anticisim kolonuna və sınaqdan keçirilən konsentrasiyalara aiddir; fərqli su matrislərində və ya daha geniş interferent profillərində eyni performansın avtomatik olaraq qorunacağı göstərilməmişdir.

Tədqiqatın güclü tərəfləri hansılardır?

• Yeni FPIA yalnız kalibrləmə ilə məhdudlaşdırılmayıb; flüoresan izləyicilərin quruluşları HPLC-HRMS və MS/MS ilə təsdiqlənib.
• İki fərqli bağlayıcı uzunluğu eksperimental şəkildə müqayisə edilib.
• Anticisim-izləyici qarşılıqlı təsiri, kinetika və işçi konsentrasiyalar ayrıca təcrübələrlə optimallaşdırılıb.
• Seçicilik yalnız hədəf analitlə deyil, bir neçə struktur analoq və əlaqəsiz pestisidlə sınaqdan keçirilib.
• Real açıq-su matrisi üzərində spike/recovery təsdiqi aparılıb.
• Mühüm 2,4-D çarpaz reaktivliyi gizlədilməyib; iki fərqli həll yolu eksperimental olaraq sınaqdan keçirilib.

Tədqiqatın məhdudiyyətləri hansılardır?

• Əsas 4-CPA FPIA-nın 2,4-D-yə çarpaz reaktivliyi %48-dir; nümunədə 2,4-D varsa birbaşa ölçmə spesifik 4-CPA təyini kimi qəbul edilə bilməz.
• İkili-FPIA riyazi yanaşmasında bildirilen %116–151 bərpa mühüm müsbət qərəzə işarə edir.
• Afinlik kolonlu həll ümidverici olsa da, məhdud sayda konsentrasiya və yalnız bir eksperimental su kontekstində göstərilib.
• Tədqiqat geniş coğrafi bölgələrdən müxtəlif təbii su növləri, qida matrisi və ya real sahə nümunələrindən ibarət böyük validasiya dəsti təqdim etmir.
• LOD üçün bildirilen 1,2 ± 1,2 ng/mL dəyəri yüksək nisbi qeyri-müəyyənlik daşıyır.
• Metod bölməsində təcrübələrin bəzi yerlərdə iki təkrar, şəkil və cədvəllərdə isə n = 3 kimi bildirilməsi təkrar quruluşu baxımından aydınlıq problemi yaradır.
• Mənbədə anticismin mənşəyi, bəzi cədvəl/tənlik nömrələri, recovery diapazonları və metod müqayisəsi mənbələrində redaktə uyğunsuzluqları var.

Türkiyə baxımından nəticə nə ifadə edir?

Tədqiqat Türkiyədəki səth sularında aparılmış ətraf mühit monitorinqi tədqiqatı deyil və Türkiyəyə aid 4-CPA istifadə tezliyi, su konsentrasiyaları və ya normativ hədlər barədə məlumat təqdim etmir. Buna görə əldə edilən analitik performans birbaşa Türkiyədəki real sahə nümunələrinə ümumiləşdirilə bilməz.

Bununla belə, sürətli, daşına bilən və az mərhələli FPIA yanaşması; yerli su matrisləri, eyni vaxtda mövcud pestisid profili və zəruri istinad metodları ilə ayrıca validasiya olunması şərtilə ətraf mühit üzrə ilkin skrininq baxımından araşdırıla bilər. Xüsusilə 2,4-D-yə bənzər struktur analoqların eyni nümunədə mövcud ola bilməsi halında seçicilik həlli validasiyanın mərkəzində olmalıdır.

Tədqiqat nəyi dəstəkləyir?

• 4-CPA-EDF və M1 kombinasiyası ilə 4-CPA üçün sürətli FPIA siqnalı yaradıla bildiyini.
• Tədqiqatın eksperimental şərtlərində 1,2 ng/mL mərkəzi dəyərli LOD və təxminən 2,3–300 ng/mL təyin diapazonu əldə edildiyini.
• 4-CPA əlavə edilmiş açıq-su nümunələrində Cədvəl 4-ə görə %98–110 bərpa əldə edildiyini.
• 2,4-D-nin 4-CPA FPIA üçün mühüm interferent olduğunu.
• 2,4-D-nin anti-2,4-D afinlik kolonu ilə əvvəlcədən uzaqlaşdırılmasının sınaqdan keçirilən qarışıqlarda 4-CPA ölçməsini yaxşılaşdıra bildiyini.

Tədqiqat nəyi sübut etmir?

• FPIA-nın bütün xromatoqrafik və ya immunokimyəvi metodlardan universal olaraq üstün olduğunu sübut etmir.
• Metodun bütün təbii su, qida və ya kənd təsərrüfatı məhsulu matrislərində eyni dəqiqliyi təmin edəcəyini göstərmir.
• İkili-FPIA riyazi düzəlişinin yüksək dəqiqliklə işlədiyini göstərmir; təqdim edilən recovery nəticələri aydın həddindən artıq qiymətləndirmə ehtiva edir.
• Afinlik kolonunun real ətraf mühit nümunələrində bütün mümkün interferentləri aradan qaldıracağını göstərmir.
• 15 dəqiqəlik analiz müddətini təkbaşına rutin normativ istinad metodunu əvəz edə biləcək sahə validasiyası kimi göstərmir.

Tədqiqatın Metodu və Nəticələri

Monoklonal anticisim istehsalı

Mənbənin metod bölməsində immunogen hazırlanmasında 2,4-D-nin BSA ilə, örtük antigeninin isə OVA ilə EDC/NHS kimyası vasitəsilə konjuqasiya edildiyi bildirilir. BALB/c siçanlar bir ilkin və dörd gücləndirici immunizasiya ilə immunizə edildi. Ən yüksək serum anticisim titrinə və inhibisiya nisbətinə malik heyvan seçildikdən sonra splenositlər SP2/0 miyeloma hüceyrələri ilə PEG vasitəli füzyona məruz qoyuldu. M1 monoklonal anticismi klassik hibridoma texnologiyası ilə əldə edildi və Protein G afinlik təmizlənməsi tətbiq olundu.

Bu metod təfərrüatı xülasə bölməsindəki “4-CPA-ya qarşı yaradılmış M1” ifadəsi ilə tam uyğun deyil. Nəticələr bölməsi M1-in 2,4-D-yə yönəlmiş hibridoma skrininqindən ortaya çıxdığını və 4-CPA-ya gözlənilmədən daha yüksək afinlik göstərdiyini izah edir.

Flüoresan izləyicilərin hazırlanması

4-CPA-nın karboksil qrupu DCC və NHS ilə aktivləşdirildi. Aktivləşdirmədən sonra reaksiya qarışığının iki hissəsinə müvafiq olaraq EDF və 6-AHF əlavə edildi. Məhsullar CHCl3:CH3OH 4:1 mobil fazası ilə TLC istifadə olunaraq ayrıldı və metanolla elüsiya edildi.

4-CPA-EDF iki CH2 qruplu qısa bağlayıcı, 4-CPA-6-AHF isə altı CH2 qruplu daha uzun bağlayıcı daşıyırdı.

HPLC-HRMS şərtləri

Quruluş təsdiqində Dionex Ultimate 3000 maye xromatoqrafı və Q Exactive hibrid yüksək ayırdetməli kütlə spektrometri istifadə edildi. Analitik kolon HypersilGold aQ, 2,1 × 100 mm və 3 µm olaraq bildirildi. Axın sürəti 0,50 mL/dəqiqə, kolon temperaturu 40 °C, inyeksiya həcmi 1 µL idi.

Mobil faza A %0,1 formik turşu olan %5 asetonitril/su; mobil faza B isə asetonitrildə %0,1 formik turşu idi. MS məlumatları 100–1000 m/z Full MS və 90–900 m/z AIF rejimlərində müsbət və mənfi ionlaşma ilə toplandı; mənfi ionlaşma struktur şərhi baxımından daha informativ hesab edildi.

FPIA ölçmə şərtləri

Dörd parametrli kalibrləmə modeli

Flüoresans polarizasiyası ilə analit konsentrasiyası arasındakı əlaqə mənbədə dörd parametrli logistik funksiya ilə modelləşdirilmişdir:

\[ Y = B + \frac{A-B}{1+\left(\frac{x}{C}\right)^D} \]

Burada x analit konsentrasiyasını, Y ölçülən flüoresans polarizasiya dəyərini, A yuxarı asimptotik FP dəyərini, B aşağı asimptotik və ya fon dəyərini, C yarımloqarifmik əyridə dönüş nöqtəsini və %50 inhibisiyaya uyğun konsentrasiyanı, D isə əyrinin dönüş nöqtəsindəki meylini müəyyən edir.

Çarpaz reaktivliyin hesablanması

Çarpaz reaktivlik mənbədə aşağıdakı əlaqə ilə hesablanmışdır:

\[ CR = \frac{IC50_{4-CPA}}{IC50_{cr}}\times100\% \]

IC50_4-CPA 4-CPA-nın anticisim-izləyici bağlanmasını %50 inhibə edən konsentrasiyasını; IC50_cr isə sınaqdan keçirilən çarpaz reaktiv birləşmənin eyni səviyyədə inhibisiya yaradan konsentrasiyasını göstərir. Yüksək CR dəyəri hədəf olmayan birləşmənin testə daha güclü müdaxilə etdiyini göstərir.

Bərpanın hesablanması

Spike/recovery validasiyasında:

\[ Recovery(\%)=\frac{C_{found}}{C_{added}}\times100\% \]

istifadə edilmişdir. C_found FPIA ilə tapılan, C_added isə nümunəyə məlum miqdarda əlavə edilən 4-CPA konsentrasiyasıdır.

Bağlı fraksiyanın hesablanması

Anticisim optimallaşdırılmasında flüoresan izləyicinin bağlı fraksiyası:

\[ F_b=\frac{mP-mP_{free}}{mP_{max}-mP_{free}} \]

bərabərliyi ilə hesablanmışdır. Burada mP ölçülən polarizasiya, mP_free sərbəst izləyicinin polarizasiyası və mP_max maksimum anticisim-izləyici bağlanmasındakı polarizasiyadır.

Əsas kəmiyyət nəticələrinin xülasəsi

Mənbə və Metod Qeydi

Tam özgün işin adı: Fluorescence Polarization Immunoassay with Modulated Selectivity for Effective Detection of the Agrochemical 4-Chlorophenoxyacetic Acid

Müəlliflər: Marya K. Kolokolova; Liliya I. Mukhametova; Boris S. Tupertsev; Anatoly V. Zherdev; Xinxin Xu; Chuanlai Xu; Sergei A. Eremin.

Müəllif sırası: Mənbədə yuxarıdakı ardıcıllıqla verilmişdir. Açıq bir ortaq birinci müəllif/bərabər töhfə bəyanı aşkar edilməmişdir.

Məsul müəllif: Sergei A. Eremin.

Qurumlar: Faculty of Chemistry, M. V. Lomonosov Moscow State University, Moskva, Rusiya; A. N. Bach Institute of Biochemistry, Research Center of Biotechnology of the Russian Academy of Sciences, Moskva, Rusiya; N. N. Semenov Federal Research Center for Chemical Physics, Russian Academy of Sciences, Moskva, Rusiya; State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi, Çin.

Mənbə növü: Rəyli orijinal tədqiqat məqaləsi (Article).

Jurnal: Biosensors.

Nəşriyyat: MDPI, Basel, Switzerland.

Cild / say / məqalə nömrəsi: 16 / 6 / 343.

DOI: 10.3390/bios16060343.

Rəsmi keçid:https://doi.org/10.3390/bios16060343

Tarixlər: Alınıb 29 aprel 2026; yenidən işlənib 8 iyun 2026; qəbul edilib 13 iyun 2026; nəşr olunub 18 iyun 2026.

Rəyçilik statusu: Tədqiqat rəsmi nəşriyyat məlumatına görə rəyli Biosensors jurnalında dərc edilmiş tədqiqat məqaləsidir.

Lisenziya: Creative Commons Attribution (CC BY); açıq giriş.

Maliyyələşdirmə: Russian Science Foundation, qrant 24-43-00196.

Etika komitəsi: Heyvan təcrübələrinin Çindəki laboratoriya heyvanları qaydalarına uyğun aparıldığı və Jiangnan University Animal Ethics Committee tərəfindən təsdiqləndiyi bildirilir.

Məlumatlandırılmış razılıq: Tətbiq olunmur.

Məlumat əlçatanlığı: Məlumatların müəlliflərdən sorğu əsasında əldə edilə biləcəyi bildirilmişdir.

Maraqların toqquşması: Müəlliflər maraqların toqquşması olmadığını bildirmişlər.

Müəllif töhfələri: Konseptuallaşdırma A.V.Z. və S.A.E.; metodologiya L.I.M.; doğrulama M.K.K., B.S.T. və L.I.M.; formal analiz B.S.T.; tədqiqat M.K.K., B.S.T., C.X., X.X. və L.I.M.; məlumatların kurasiyası M.K.K. və A.V.Z.; ilkin layihə L.I.M. və M.K.K.; nəzərdən keçirmə/redaktə A.V.Z. və S.A.E.; vizuallaşdırma C.X.; rəhbərlik A.V.Z. və S.A.E.; layihə idarəetməsi A.V.Z. və C.X.; maliyyələşdirmənin əldə edilməsi S.A.E.

Mənbə daxilində uyğunsuzluqlar

M1 anticisminin mənşəyi: Xülasə M1-i 4-CPA-ya qarşı yaradılmış anticisim kimi təsvir etdiyi halda metod və nəticə bölmələri M1-in 2,4-D-yə yönəlmiş hibridoma tədqiqatından çıxdığını və 4-CPA-ya gözlənilməz yüksək afinlik göstərdiyini bildirir. Verianla məqaləsi metod/nəticə izahını əsas götürmüş və bu ziddiyyəti görünən saxlamışdır.

Recovery diapazonu: Xülasə və nəticə bölməsində %98–112 ifadəsi olmasına baxmayaraq eksperimental Cədvəl 4-də dörd dəyər %98, %102, %103 və %110-dur. Əsas elmi mətndə Cədvəl 4-ün %98–110 diapazonundan istifadə edilmişdir.

İkili-FPIA recovery: Cədvəl 5 %116, %138 və %151 dəyərlərini verdiyi halda sonrakı mətn diapazonu %99–151 kimi ifadə edir. Verianla mətnində faktiki cədvəl dəyərləri əsas götürülmüşdür.

Nümunə sayları/konsentrasiyaları: metod bölməsində açıq-su nümunələrinin 2,5; 5; 10; 50; 200 və 500 ng/mL səviyyələrində spike edildiyi bildirildiyi halda nəticə bölməsində “yeddi” nümunə ifadəsi işlədilir və Cədvəl 4 yalnız 5, 10, 50 və 200 ng/mL səviyyələrini bildirir. Çatışmayan səviyyələr üçün məlumat uydurulmamışdır.

Tənlik və cədvəl çarpaz istinadları: mətndə bəzi yerlərdə çarpaz reaktivlik və ya ikili-analit tənliklərinə əvvəlki nömrələrlə istinad edilir. Tənliklər bu məqalədə riyazi məzmunlarına görə verilmiş, mənbə nömrələmə xətası səssiz şəkildə elmi məlumat dəyişikliklərinə çevrilməmişdir.

Qısaltmalar bölməsi: 2,4-D-nin açılışı qısaltmalar siyahısında əsas mətndəki “2,4-dichlorophenoxyacetic acid” adlandırması ilə uyğun olmayan şəkildə yazılmışdır. Eyni şəkildə 2,4,5-T adlandırmasında da əsas mətnlə terminoloji fərq var.

Müqayisəli metod cədvəli: Mənbənin Cədvəl 7-dəki bəzi metod–istinad uyğunluqları biblioqrafiya ilə tam uzlaşmır. Bundan əlavə, məqalənin girişində çox daha aşağı LOD bildirən bəzi xromatoqrafik nümunələr xatırlandığı halda nəticə bölməsində FPIA-nın bir çox instrumental metodu üstələdiyi istiqamətində daha geniş qiymətləndirmə aparılmışdır. Buna görə Verianla məqaləsi “FPIA bütün instrumental metodlardan üstündür” nəticəsini qəbul etmir.

Elmi sərhəd: Tədqiqat 4-CPA üçün sürətli FPIA hazırlanmasını və müəyyən su nümunələrində təsdiqlənməsini dəstəkləyir. Lakin real ətraf mühit monitorinq şəbəkələrində genişmiqyaslı sahə validasiyası, çoxmərkəzli təkrar istehsal oluna bilmə və ya müxtəlif su/qida matrislərində universal performans göstərilməmişdir.

Verianla mənbə qeydi: Elmi məzmun yüklənmiş 22 səhifəlik tədqiqatın metod, formul, cədvəl, qrafik, HPLC-HRMS/MS spektrləri, kalibrləmə məlumatları, recovery testləri, çarpaz reaktivlik təcrübələri, afinlik kolonu tədqiqatları, nəticə, maliyyələşdirmə, etika, məlumat əlçatanlığı və müəllif töhfələri bölmələri araşdırılaraq hazırlanmışdır. Xarici mənbələr yalnız biblioqrafik kimlik və nəşr statusunun doğrulanması üçün istifadə edilmiş; əsas elmi izaha xaricdən yeni eksperimental nəticə əlavə edilməmişdir.