Мушкилоти асосии ин таҳқиқот он аст, ки барои фаҳмидани истифодаи опиоидҳо дар сатҳи ҷомеа усулҳои таҳлилии боэътимод, ҳассос ва барои лабораторияҳои гуногун дастрас заруранд. Бӯҳрони опиоид, хусусан бо паҳншавии опиоидҳои синтетикӣ ба монанди фентанил ва ҳосилаҳои он, ба масъалаи ҷиддии саломатии ҷамъиятӣ табдил ёфтааст. Манбаъҳои анъанавии маълумот, аз ҷумла пурсишҳо, сабтҳои беморхона, марг аз вояи зиёдатӣ, муроҷиат ба табобат, маълумоти мақомоти ҳифзи ҳуқуқ ва маводи мусодирашуда, бисёр вақт нишондодҳои ғайримустақим ё деррас мебошанд. Онҳо муҳиманд, аммо тамоюли воқеии истифодаи маводро ҳамеша сари вақт, бетарафона ва бо ҷузъиёти кофӣ нишон дода наметавонанд.

Эпидемиологияи асосёфта ба оби партов, яъне wastewater-based epidemiology ё WBE, барои пур кардани ҳамин холигӣ рушд кардааст. Оби партови воридшаванда ба шабакаи канализатсия метавонад метаболитҳои доруҳо, моддаҳои кимиёвӣ ва нишонаҳои биологии аз пешоб ва наҷоси сокинон хориҷшударо дар бар гирад. Бо таҳлили ин намунаҳо ҳадаф пайгирии шахсони алоҳида нест, балки фаҳмидани тамоюлҳои умумии ҷомеа мебошад. Аз ин рӯ, WBE метавонад барои огоҳии барвақт, назорати минтақавӣ ва банақшагирии захираҳо дар масъалаҳое чун истифодаи опиоидҳо воситаи арзишманд бошад.

Аммо таҳлили опиоидҳо дар оби партов аз ҷиҳати техникӣ душвор аст. Пайвастҳои ҳадаф аксар вақт дар сатҳи ng/L ё ppt мавҷуданд. Матритсаи оби партов бошад, хеле мураккаб аст: моддаҳои органикӣ, намакҳо, боқимондаҳои шустушӯй, зарраҳои биологӣ, дигар доруҳо ва дахолатҳои гуногуни кимиёвӣ ҳамзамон дар як намуна дида мешаванд. Дар чунин замина ҷудо, шинохт ва чен кардани миқдорҳои хеле пасти метаболитҳои опиоидҳо ҳассосияти баланд ва интихобпазирии хуб талаб мекунад.

Аҳамияти ин кор дар ҳамин нуқта пайдо мешавад. Дар адабиёт таҳлилҳои сатҳи ppt аксаран бо масс-спектрометрияи баландҳаллият, яъне HRMS, ё бо triple quadrupole-ҳои премиум алоқаманд мебошанд. Ин дастгоҳҳо тавоноанд, вале гарон, ниёзманди мутахассис ва барои ҳамаи лабораторияҳои саломатии ҷамъиятӣ ё мониторинги муҳити зист дастрас нестанд. Муаллифон аз ин рӯ саволи амалӣ мегузоранд: агар тайёркунии намуна ва шароити ченкунӣ дуруст оптимизатсия шаванд, оё бо triple quadrupole LC-MS/MS миёнасатҳ низ ченкунии опиоидҳо дар сатҳи ppt имконпазир аст?

Ҷавоби таҳқиқот дар шароити муайян мусбат аст. Муаллифон дар платформаи SCIEX Triple Quad 3500, ки ҳамчун системаи triple quadrupole миёнасатҳ арзёбӣ мешавад, ғанигардонии SPE, бозҳалкунии экстракт дар %100 об, ҳаҷми калони тазриқ ва стратегияи scheduled MRM-ро якҷо истифода бурда, ҳассосияти баланд ба даст овардаанд.

Дар таҳқиқот ҳафт аналит ҳадаф қарор гирифтааст: морфин; M3G ё morphine-3-glucuronide; M6G ё morphine-6-glucuronide; norfentanil; noroxycodone; methadone; ва EDDP. Морфин ҳам ҳамчун опиоиди доруӣ ва ҳам ҳамчун нишондиҳандаи марбут ба метаболизми героин аҳамият дорад. M3G ва M6G метаболитҳои глюкуронидии морфинанд ва аз ҷиҳати сохтор ба ҳам хеле монанд мебошанд. Norfentanil нишондиҳандаи муҳими таъсири фентанил аст. Noroxycodone ба метаболизми оксикодон алоқаманд аст. Methadone дар идоракунии дард ва табобати вобастагии опиоид истифода мешавад. EDDP бошад, метаболити асосии methadone буда, дар WBE барои пайгирии таъсири methadone истифода мешавад.

Ин интихоби панел нишон медиҳад, ки таҳқиқот танҳо намепурсад «кадом пайвастҳоро чен кардан мумкин аст?», балки инчунин ба саволи WBE таваҷҷуҳ мекунад: «кадом метаболитҳо барои тамоюли ҷомеавӣ нишондиҳандаи маънонок буда метавонанд?» Дохил кардани метаболитҳои глюкуронидӣ махсусан муҳим аст, зеро онҳо қутбӣ, ба ҳам монанд ва дар матритсаи оби партов бо консентратсияҳои паст дучор мешаванд.

Марҳилаи аввалини муҳим тайёр кардани калибраторҳо ва намунаҳои назорати сифат буд. Маҳлули захиравии асосӣ барои ҳар аналит дар консентратсияи 2.000 ng/mL омода карда шуд. Бо силсилаи рақиқсозӣ каҷҳои калибронӣ аз 0,008 то 2.000 ng/mL бо 19 нуқта сохта шуданд. Барои аксари аналитҳо дар тазриқи 50 µL диапазони хаттии 0–250 ng/mL муайян гардид. Намунаҳои назорати сифат дар сатҳҳои паст, миёна ва баланд барои санҷиши иҷрои усул истифода шуданд.

Муҳити бозҳалкунӣ барои муваффақияти хроматографӣ ҳалкунанда буд. Дар оғоз таносубҳои гуногуни метанол/об санҷида шуданд: %100 метанол, 75:25 метанол/об, 50:50 метанол/об, 25:75 метанол/об ва %100 об. Азбаски оғози градиенти LC обӣ буд, мувофиқати намуна ба фазаи ибтидоӣ шакли қулларо беҳтар кард. Бозҳалкунӣ дар %100 об, махсусан барои морфин, M3G ва M6G, қуллаҳои тезтар ва сигнали баландтар дод.

Шакли 4 дар саҳифаи 21 ин оптимизатсияро нишон медиҳад. Вақте ки метанол зиёд буд, дар баъзе аналитҳо паҳншавии пеши қулла, думдорӣ ё сигнали паст мушоҳида шуд; дар шароити %100 об бошад, барои морфин ва метаболитҳои глюкуронидӣ қуллаҳои ҳамвортар ва қавитар ба даст омаданд. Ин нишон медиҳад, ки ҳассосияти усул танҳо аз масс-спектрометр вобаста нест, балки аз параметри зоҳиран содда, вале хеле муҳим — дар кадом ҳалкунанда тазриқ шудани намуна — низ таъсир мегирад.

Марҳилаи дуюми муҳим solid phase extraction ё SPE буд. Намунаҳои оби партов то pH 2,5 турш карда шуданд, то устувории аналитҳо ва пайвастшавии онҳо ба картриҷи полимерии Strata-XC беҳтар гардад. Картриҷҳо бо метанол ва оби туршшуда шартӣ гардонида шуданд; намунаҳо таҳти вакуум бор карда шуданд; картриҷҳо бо об шуста, дар вакуум хушк ва аналитҳо бо метаноли дорои %2 аммиак элюатсия шуданд. Элюатҳо дар 40 °C зери нитроген хушк ва пеш аз таҳлил дар оби дараҷаи HPLC боз ҳал карда шуданд.

Scheme 1 ҷараёни корро пас аз SPE ба таври схемавӣ нишон медиҳад. Он табдили 50 mL намуна ба экстракти хурдҳаҷм, хушккунӣ, бозҳалкунӣ ва омода кардани найчаҳо дар шароити ҳалкунандаҳои гуногунро нишон медиҳад. Мантиқи асосӣ чунин аст: аз намунаи калонҳаҷми муҳити зист аналитҳои ҳадаф ғанӣ карда мешаванд ва сипас бо ҳаҷми калони тазриқ дар дастгоҳ ҳассосият боло бурда мешавад.

Дар ин ҷо тавозуни муҳим мавҷуд аст. Муаллифон нишон медиҳанд, ки бозҳалкунӣ дар %100 об барои баъзе аналитҳо бозёфтро кам кард. Аммо ҳамин кор имкон дод, ки ҳаҷми тазриқ аз 5 µL ба 50 µL зиёд шавад. Яъне ҳатто агар бозёфти мутлақ %10–40 кам шавад, афзоиши 10-каратаи ҳаҷми тазриқ барои сигнали умумӣ бартарии равшан медиҳад. Ин яке аз қоидаҳои амалии кимиёи таҳлилӣ аст: усули беҳтарин ҳамеша усуле нест, ки як параметрро ба ҳадди баландтарин мерасонад, балки усулест, ки ҳассосият, шакли қулла, бозёфт, такрорпазирӣ ва таҳаммули матритсаро мувозинат мекунад.

Усули масс-спектрометрӣ дар positive electrospray ionization, яъне ESI positive mode, таҳия шуд. Барои ҳар аналит гузаришҳои multiple reaction monitoring, ё MRM, оптимизатсия гардиданд. MRM дар triple quadrupole имкон медиҳад, ки иони модар ва ионҳои маҳсулоти мушаххас назорат шаванд; ҳамин интихобпазирӣ ва ҳассосиятро меафзояд. Барои ҳар аналит як гузариши асосии миқдорӣ ва як ё ду гузариши тасдиқкунанда интихоб шуд.

Мантиқи MRM чунин ифода мешавад:

\[ Q1: ext{ана ион} ightarrow Q3: ext{ион маҳсулот} \]

Q1 иони модарро бо mass-to-charge ratio муайян интихоб мекунад. Дар ҳуҷайраи бархӯрд ин ион пора мешавад. Q3 маҳсулоти муайянро пайгирӣ мекунад. Агар иони модар, иони маҳсулот ва вақти нигоҳдорӣ ҳама дуруст бошанд, шиносоии пайваст боэътимодтар мегардад.

Шакли 1 дар саҳифаи 19 спектрҳои порашаваии намояндагиро барои EDDP, M6G, M3G, морфин, norfentanil, noroxycodone ва methadone нишон медиҳад. Ин шакл далели интихоб шудани гузаришҳои MRM мебошад. Барои M3G ва M6G, ки изомерҳои сохтории хеле наздиканд, танҳо масса кофӣ нест; вақти нигоҳдорӣ ва гузаришҳои маҳсулот бояд якҷо истифода шаванд.

Scheduled MRM ҳар аналитро танҳо дар равзанаи вақтӣ атрофи вақти интизоршудаи нигоҳдорӣ назорат мекунад. Дар ин кор равзанаи MRM 40 сония буд. Ин равиш шумораи гузаришҳои ҳамзамонро кам, самаранокии ҷамъоварии маълумотро зиёд ва signal/noise-ро беҳтар мекунад. Муаллифон қайд мекунанд, ки scheduled MRM барои метаболитҳои глюкуронидӣ нисбат ба усули unscheduled тақрибан %10 беҳтарии signal/noise дод.

Барои ҷудокунии LC сутуни Kinetex Biphenyl истифода шуд. Ин интихоб барои ҷудо кардани метаболитҳои сохторӣ монанд муҳим буд. Фазаи A оби дараҷаи LC-MS бо 2 mM ammonium formate ва фазаи B метанол бо 2 mM ammonium formate буд. Градиент 11 дақиқа давом кард: оғоз бо %100 A, дар дақиқаи 4 %80 A/%20 B, аз 7 то 9,5 дақиқа %100 B ва сипас бозгашт ба шароити аввал. Ҳарорати сутун 30 °C буд.

Шакли 2 дар саҳифаи 20 extracted ion chromatogram ё XIC-и намунаи оби партови spike-шударо нишон медиҳад. Norfentanil, noroxycodone, EDDP, methadone, M3G, M6G ва morfin ҳамчун қуллаҳои ҷудошуда нишон дода шудаанд. Шакли 3 бошад, хроматограммаҳои influent ва effluent-и ҳамон рӯзро нишон медиҳад. Ин нишон медиҳад, ки усул на танҳо дар стандартҳо, балки дар намунаҳои воқеии саҳроӣ низ кор мекунад.

Натиҷаҳои хаттият эътимоднокии усулро дастгирӣ мекунанд. R² барои морфин 0,9998; барои M3G 0,9999; барои M6G 0,9999; барои norfentanil 0,999; барои noroxycodone 0,9992; ва барои EDDP 0,9992 буд. Қиматҳои наздик ба 1 нишон медиҳанд, ки робитаи сигнал ва консентратсия барои миқдорсанҷӣ қавӣ аст.

Ҳассосият бо lower limit of quantitation нишон дода шуд. LOQ дар сатҳи намуна чунин буд: noroxycodone 0,31 ng/L, EDDP 0,61 ng/L, morfin 4,88 ng/L, M6G 0,61 ng/L, M3G 0,08 ng/L, norfentanil 0,61 ng/L ва methadone 9,77 ng/L. Ин нишон медиҳад, ки барои аксари аналитҳо ченкунӣ дар сатҳи ng/L ё беҳтар имконпазир буд.

Меъёри муайянкунии LOQ ба signal/noise асос ёфт:

[ S/N > 10 ]

Ин маъно дорад, ки сигнал бояд аз садои замина бештар аз 10 маротиба баланд бошад, то миқдорсанҷӣ қобили қабул дониста шавад.

Дақиқӣ ва саҳеҳӣ бо намунаҳои назорати сифат арзёбӣ шуда, дар ҳудуди ±%15-и арзиши номиналӣ гузориш шуданд. Таъсири матритса низ санҷида шуд: намунаҳои spike-шуда дар оби деионизатсияшуда ва дар оби партов муқоиса гардиданд; фарқ дар калонӣ, нишебӣ ва хаттият аз %5 кам буд. Ин нишон медиҳад, ки таъсири матритса маҳдуд мондааст.

Ҷадвали 5 бозёфти стандартҳои дохилии дейтерийдорро пас аз бозҳалкунӣ дар об медиҳад: noroxycodone-d3 %23 ± 4,52; EDDP-d3 %13 ± 3,54; morfin-d3 %80 ± 2,99; M6G-d3 %26 ± 10,33; M3G-d3 %35 ± 6,84; norfentanil-d5 %56 ± 4,06; methadone-d3 %24 ± 4,01. Ин қиматҳо нишон медиҳанд, ки бозёфт барои баъзе аналитҳо паст аст; аммо истифодаи стандартҳои дохилии изотопӣ талафоти экстраксия ва тағйироти матритсаро дар миқдорсанҷӣ ҷуброн кардааст.

Намунаҳои воқеии оби партов аз як иншооти коркарди оби партови минтақаи Greater Albany, New York гирифта шуданд. Шаш намуна таҳлил шуд: барои рӯзҳои душанбе, панҷшанбе ва якшанбе як намунаи influent ва як намунаи effluent. Намунаҳо барои кори қаблӣ ҷамъоварӣ шуда, дар шишаҳои пластикӣ дар -20 °C нигоҳдорӣ гардида буданд.

Ин қиматҳо нишон медиҳанд, ки усул метавонад метаболитҳои опиоидро дар сатҳи ng/L дар намунаҳои воқеии оби партов фарқ кунад. Аммо ин натиҷаҳо ба ҳисобкунии мустақими миқдори истифодаи ҷомеавӣ табдил дода нашудаанд. Барои чунин ҳисобҳо ҷараёни оби партов, шумораи аҳолӣ, устувории метаболит, вайроншавӣ дар канализатсия, динамикаи иншооти коркард ва манбаъҳои беруниро ба назар гирифтан лозим аст.

Морфин ва глюкуронидҳои он дар намунаҳои воқеӣ ошкор нашуданд. Ин метавонад маънои онро дошта бошад, ки онҳо дар консентратсияи ченшаванда вуҷуд надоштанд ё нигоҳдорӣ, вайроншавӣ, вақти намунагирӣ, шароити канализатсия ва матритса онҳоро аз ҳадди миқдорсанҷӣ поин бурдаанд.

Ҷадвали 7 усулро бо усулҳои пешини LC-MS/MS барои таҳлили опиоидҳо дар оби партов муқоиса мекунад. Нуқтаи фарқкунандаи ин кор он аст, ки бе HRMS ва бе платформаи премиум, дар SCIEX Triple Quad 3500, бо тазриқи 50 µL ва бозҳалкунӣ дар %100 об ҳассосияти ng/L ба даст оварда шудааст. Давоми таҳлил 11 дақиқа буда, барои таҳлили рутинӣ амалӣ менамояд.

Аҳамияти таърихии кор дар он аст, ки он масъалаи дастрасии таҷҳизотро дар WBE ба миён мегузорад. Агар ҳассосияти баланд танҳо бо дастгоҳҳои бисёр гарон дастрас бошад, WBE дар доираи чанд лаборатория маҳдуд мемонад. Ин таҳқиқот нишон медиҳад, ки бо оптимизатсияи дурусти намуна ва LC-MS/MS платформаҳои дастрастар низ метавонанд натиҷаи қавӣ диҳанд.

Арзиши имрӯзии кор дар он аст, ки дар шароити бӯҳрони опиоид, аз ҷумла мавҷи опиоидҳои синтетикӣ, лабораторияҳои бештар метавонанд мониторинги экологӣ ва ҷомеавӣ анҷом диҳанд. Norfentanil ва EDDP барои фаҳмидани тамоюлҳои сатҳи ҷомеа нишондиҳандаҳои муҳим буда метавонанд.

Дар оянда ин усул метавонад ба панелҳои васеътари опиоидҳо, метаболитҳои нави опиоидҳои синтетикӣ, шаҳрҳои гуногун ва таҳқиқоти тӯлонӣ васеъ карда шавад. Агар он бо стратегияи намунагирӣ, санҷиши устуворӣ, меъёри нестшавӣ дар иншооти коркард ва ҳисобҳои normalize-шуда ба аҳолӣ пайваст шавад, барои банақшагирии саломатии ҷамъиятӣ маълумоти қавитар медиҳад. Бо вуҷуди ин, худи ин таҳқиқот чунин хулосаҳои эпидемиологиро мустақим намекунад; он пеш аз ҳама усули таҳлилиро месанҷад.

Таъсири рӯзмарраи он назорати шахсӣ ё мақсадҳои ҷазоӣ нест. WBE, агар аз ҷиҳати ахлоқӣ дуруст истифода шавад, шахсони алоҳидаро не, балки тамоюлҳои беноми сатҳи ҷомеаро пайгирӣ мекунад. Ин метавонад ба банақшагирии табобат, барномаҳои коҳиши зарар, дарёфти барвақти мавҷҳои нави опиоидҳои синтетикӣ ва тақсимоти беҳтари захираҳо кумак кунад.

Қувватҳои таҳқиқот: ҳадафи ҳассосияти ppt дар triple quadrupole миёнасатҳ; ғанигардонии SPE бо тақрибан 100 маротиба пешконсентратсия; бозҳалкунӣ дар об ва тазриқи калонҳаҷм; scheduled MRM барои аналитҳои монанд; хаттияти баланд; татбиқ дар намунаҳои воқеӣ; ва муқоиса бо адабиёти пешин. Маҳдудиятҳо: мақола preprint аст; намунаҳои воқеӣ каманд; танҳо шаш намуна аз як минтақа таҳлил шудааст; морфин ва глюкуронидҳо дар намунаҳои саҳроӣ мусбат набуданд; бозёфт барои баъзе аналитҳо паст аст; ва аз консентратсияҳои ченшуда истеъмоли ҷомеавӣ ҳисоб нашудааст.

Хулоса, таҳқиқот нишон медиҳад, ки таҳлили опиоидҳо ва метаболитҳои онҳо дар оби партов ҳатман ба гаронтарин платформаҳои масс-спектрометрӣ вобаста нест. Саҳми асосӣ нишон додани он аст, ки SPE, бозҳалкунӣ дар об, тазриқи калонҳаҷм ва scheduled MRM якҷо метавонанд ҳатто дар triple quadrupole миёнасатҳ мониторинги сатҳи ppt-ро имконпазир созанд. Аммо натиҷаҳо preprint буда, бо намунаҳои бештар, шароити гуногуни оби партов ва арзёбии ҳамтоён бояд мустаҳкам шаванд.

Усул ва натиҷаҳои таҳқиқот

Усул аз интихоби панел, омода кардани стандартҳо ва QC, ғанигардонии SPE, бозҳалкунӣ дар %100 об, тазриқи 50 µL HPLC-MS/MS, оптимизатсияи scheduled MRM, арзёбии калибронӣ, хаттият, LOQ, бозёфт, таъсири матритса ва таҳлили намунаҳои воқеӣ иборат буд.

Натиҷаи умумӣ он аст, ки дар шароити оптимизатсияшуда платформаи миёнасатҳ метавонад барои WBE ҳассосияти кофӣ диҳад. Ин усул барои истифодаи клиникӣ ё далели шахсӣ пешбинӣ нашудааст; он усули таҳлилии мониторинги ҷомеавӣ мебошад.

Ёддошт оид ба манбаъ ва усул

Ин матн бар асоси таҳқиқоти Thomas Regan, Ian Riley, Muhit Rana, Pengfei Xie ва Avni A. Argun бо номи “Highly sensitive HPLC-MS/MS quantitation of opioids and morphine glucuronides in wastewater using a mid-range triple quadrupole platform” омода шудааст. Манбаъ мақолаи preprint мебошад ва дар он гуфта шудааст: “This preprint research paper has not been peer reviewed”. Аз ин рӯ натиҷаҳо ҳамчун маълумоти пешакии усули таҳлилӣ хонда мешаванд. Дар ин шарҳ даъвои клиникӣ, исботи истифодаи шахсӣ, тавсияи ҳуқуқӣ ё ҳисобкунии қатъии истеъмоли ҷомеавӣ илова нашудааст.