Karmaşık bitkisel formüllerin hangi bileşenlerinin biyolojik etkilere katkı sağladığını belirlemek, tek bileşenli ilaçların analizinden çok daha zordur. Bir bitkisel formül yüzlerce farklı molekül içerebilir; bu moleküller polarite, kararlılık, miktar, bağırsaktan geçiş ve metabolizmaya uğrama biçimleri bakımından birbirinden ayrılır.

Geleneksel analitik yaklaşımlarda önce formülün kimyasal bileşimi belirlenir, ardından kanda değişmeden bulunan “prototip” bileşenler araştırılır. Ancak bir bileşiğin kanda özgün moleküler yapısıyla bulunmaması, onun etkisiz olduğu anlamına gelmeyebilir. Bazı bileşikler bağırsak bakterileri tarafından parçalanabilir, şekeri uzaklaştırılabilir, indirgenebilir veya başka metabolitlere dönüştürülebilir. Oluşan ürün, ana bileşikten daha kolay emilebilir veya farklı biyolojik özelliklere sahip olabilir.

Xi Chen ve çalışma arkadaşları, bu analitik kör noktayı azaltmak amacıyla bağırsak mikrobiyotasını doğrudan bileşen eleme stratejisine dahil eden bir iş akışı geliştirmiştir. Yöntem, hiperürisemi ve gut için geleneksel olarak kullanılan dokuz bitkili Qu-Zhuo-Tong-Bi dekoksiyonu, kısaca QZTBD üzerinde bir kavram kanıtlama çalışması olarak uygulanmıştır.

İlk aşamada QZTBD’nin kapsamlı kimyasal profili UPLC-Q-TOF-MS^E ile çıkarılmış ve toplam 221 bileşen tanımlanmış veya geçici olarak açıklanmıştır. Bu bileşenler arasında 51 terpen, 46 flavonoid, 32 alkaloid, 30 fenol, 11 lipid, 9 amino asit ve türevi, 9 kumarin, 5 steroid, 4 karbonhidrat, 3 organik asit, 3 saponin, 2 lignan ve 16 diğer bileşen bulunmaktadır.

QZTBD verilen sıçanların serumları incelendiğinde 221 bileşenin yalnızca 42’si değişmemiş prototip biçiminde sistemik dolaşımda saptanmıştır. Başka bir ifadeyle formülde belirlenen bileşenlerin yaklaşık yüzde 19’u prototip olarak serumda görülmüş, yaklaşık yüzde 81’i oluşturan 179 bileşen özgün biçimiyle saptanmamıştır.

Araştırmacılar bu 179 bileşeni doğrudan “etkisiz” kabul etmek yerine iki aşamalı bağırsak mikrobiyotası taramasına almıştır. İlk aşamada normal bağırsak mikrobiyotasına sahip QZTBD verilen sıçanlarla, geniş spektrumlu antibiyotik kokteyliyle mikrobiyotası azaltılan QZTBD verilen sıçanların dışkı profilleri karşılaştırılmıştır.

Antibiyotik verilen sıçanların dışkısında 19 bileşenin sinyali yükselmiştir. Araştırmacılar bu birikimi, normal koşullarda söz konusu bileşenlerin bağırsak mikroorganizmaları tarafından tüketilebildiği, parçalanabildiği veya dönüştürülebildiği yönünde bir işaret olarak yorumlamıştır. Mikrobiyota azaltıldığında bu kullanım veya dönüşüm azalmış ve ana bileşenler dışkıda daha fazla kalmış olabilir.

İkinci aşamada bu 19 aday, 25–47 yaşları arasındaki 62 erkek gut hastasından elde edilen dışkı mikrobiyotasıyla anaerobik ortamda 72 saat inkübe edilmiştir. Mikrobiyota içeren ortam ile mikroorganizma bulunmayan kontrol ortamı karşılaştırıldığında dokuz bileşenin sinyali anlamlı biçimde azalmıştır.

Bu dokuz bileşen; quercitrin, sweroside, hesperidin, 3-caffeoylshikimic acid, diosmin, avicularin, engeletin, 5-O-caffeoylshikimic acid ve dehydrocorydaline olarak gösterilmiştir. Ancak bunlar yapısı belirlenmiş mikrobiyal metabolitler değildir. Çalışma yalnızca ana bileşen sinyalinin mikrobiyota varlığında azaldığını göstermektedir.

Serumda prototip olarak bulunan sekiz temsilci ile mikrobiyota dönüşümüne aday bileşenler arasından, farmakolojik ilgi ve referans standart bulunabilirliği de dikkate alınarak 15 bileşen hedefli nicel analiz paneline seçilmiştir. Bu panel; engeletin, avicularin, corydaline, D-tetrahydropalmatine, proline betaine, quercitrin, astilbin, luteolin, diosmin, hesperidin, oxypeucedanin hydrate, palmatine, dioscin, sweroside ve dehydrocorydaline’den oluşmaktadır.

Bu 15 bileşenin aynı analizde ölçülmesi için üçlü kuadrupol LC-MS/MS cihazında çoklu reaksiyon izleme, yani MRM yöntemi geliştirilmiştir. Yöntem özgüllük, doğrusallık, miktar tayin sınırı, cihaz kesinliği, gün içi ve günler arası kesinlik, tekrarlanabilirlik, geri kazanım ve 24 saatlik çözelti kararlılığı açısından değerlendirilmiştir.

QZTBD örneklerinde en yüksek miktarlarda bulunan bileşenler genel olarak astilbin, engeletin, quercitrin ve proline betaine olmuştur. Tablo 2’deki 15 örnekte astilbin yaklaşık 107,203–315,430 µg/g, engeletin 22,925–105,325 µg/g, quercitrin 28,584–97,616 µg/g ve proline betaine 8,285–41,809 µg/g aralıklarında bildirilmiştir.

Çalışmanın son aşamasında bağırsak mikrobiyotasının QZTBD’nin farmakodinamik etkisine katkısı, yüksek yağlı diyet ve monosodyum ürat kristaliyle oluşturulan gut benzeri fare modelinde incelenmiştir. QZTBD uygulaması serum ürik asidini ve kreatinini azaltmış; inflamasyon göstergelerinde, ayak şişliğinde ve mekanik ağrı hassasiyetinde iyileşmeyle ilişkilendirilmiştir.

Bağırsak mikrobiyotası antibiyotiklerle azaltıldığında bu iyileşmelerin bir bölümü zayıflamıştır. Bu sonuç, QZTBD’nin fare modelindeki etkisinin en azından kısmen bağırsak mikrobiyotasıyla ilişkili olabileceğini desteklemektedir.

Bununla birlikte antibiyotik deneyi belirli bir bakterinin, enzimin veya metabolitin nedensel rolünü göstermemektedir. Antibiyotikler mikrobiyotayı geniş çapta değiştirebilir ve konak fizyolojisini doğrudan da etkileyebilir. Ayrıca tek tek seçilmiş 15 bileşenin veya mikrobiyal dönüşüm ürünlerinin hayvanlara verilerek etkinliklerinin sınandığı bir deney yapılmamıştır.

Çalışmanın temel katkısı yeni bir gut tedavisini klinik olarak kanıtlamak değil; karmaşık bitkisel formüllerde yalnızca kanda değişmeden görülen moleküllere odaklanmanın yetersiz olabileceğini ve bağırsak mikrobiyotasıyla dönüşme olasılığının analitik bileşen seçimine dahil edilebileceğini göstermektir.

Karmaşık bitkisel formüllerde “aktif bileşen” neden kolayca belirlenemiyor?

Tek bir saf kimyasal madde içeren ilaçta analiz edilecek ana molekül bellidir. Buna karşılık bir bitkisel dekoksiyon:

• Birden fazla bitkiden,
• Yüzlerce ana ve yan bileşenden,
• Farklı polaritedeki moleküllerden,
• Şeker taşıyan glikozitlerden,
• Alkaloidlerden, flavonoidlerden ve terpenlerden,
• Suda çözünen ve yağda çözünen fraksiyonlardan oluşabilir.

Bir bileşenin formül içinde bol bulunması, bağırsaktan değişmeden emileceği anlamına gelmez. Tersine, formülde düşük miktarda bulunan bir molekül yüksek emilim veya güçlü biyolojik aktivite gösterebilir.

Özellikle glikozitler, saponinler ve bazı yüksek polariteli moleküller bağırsak zarından prototip biçiminde sınırlı geçebilir. Bu bileşiklerin şeker grupları bağırsak mikroorganizmalarının enzimleri tarafından uzaklaştırıldığında daha küçük ve daha lipofilik aglikonlar oluşabilir.

Bu nedenle üç ayrı soru birbirinden ayrılmalıdır:

1. Formülde hangi moleküller bulunuyor?
2. Bu moleküllerden hangileri değişmeden kana geçiyor?
3. Değişmeden kana geçmeyenlerden hangileri bağırsakta biyolojik açıdan anlamlı ürünlere dönüşebilir?

Çalışmanın yenilik iddiası özellikle üçüncü soruyu analitik iş akışına dahil etmesidir.

Prototip bileşen ile dönüşüm öncülü arasındaki fark

“Prototip emilmiş bileşen”, formülde bulunduğu kimyasal biçimle serumda saptanan moleküldür. Örneğin molekülün moleküler kütlesi, alıkonma zamanı ve MS/MS parçalanma deseni formüldeki standartla uyumluysa prototip olarak emildiği kabul edilir.

“Prototip olarak emilmeyen bileşen” ise formülde belirlenmesine rağmen serumda aynı biçimiyle saptanmayan moleküldür. Bunun birkaç olası nedeni vardır:

• Bağırsaktan hiç emilmemesi,
• Bağırsak mikroorganizmalarınca dönüştürülmesi,
• Bağırsak hücrelerinde metabolize edilmesi,
• Karaciğer ilk geçiş metabolizmasına uğraması,
• Dışkıyla değişmeden atılması,
• Analitik algılama sınırının altında kalması,
• Örnekleme zamanında serumda bulunmaması.

Dolayısıyla “serumda prototip yok” sonucu, “farmakolojik katkısı yok” sonucuyla aynı değildir.

Bağırsak mikroorganizmaları molekülleri nasıl değiştirebilir?

Çalışmada bağırsak mikrobiyotasının geniş bir enzim repertuvarına sahip olduğu vurgulanmaktadır. Bunlar arasında:

• β-glukozidaz,
• β-glukuronidaz,
• Nitroredüktaz,
• Redüktaz,
• Esteraz ve benzeri mikrobiyal enzimler bulunmaktadır.

Bu enzimler şeker bağlarını kesebilir, esterleri hidroliz edebilir, bazı fonksiyonel grupları indirgeme veya yükseltgeme reaksiyonlarına sokabilir. Böylece ana bileşiğin moleküler büyüklüğü, çözünürlüğü ve biyolojik hedeflerle etkileşimi değişebilir.

Ancak mevcut çalışma bu enzimlerin hangisinin QZTBD bileşenlerinden hangisini dönüştürdüğünü ölçmemiştir. Mikrobiyota aracılı dönüşüm, bileşen sinyalindeki değişime dayalı olarak önceliklendirilmiştir.

Qu-Zhuo-Tong-Bi dekoksiyonu hangi bitkilerden oluşuyor?

QZTBD dokuz bitkisel bileşenden hazırlanmıştır:

Bitkiler önce hacimlerinin on katı deiyonize suda bir saat bekletilmiş ve 40 dakika kaynatılmıştır. Kalan bitki posası daha sonra sekiz hacim suyla 30 dakika ikinci kez kaynatılmıştır. İki filtrat birleştirilmiş, süzülmüş, yoğunlaştırılmış ve 4°C’de saklanmıştır.

Çalışmanın bütünleşik iş akışı

Araştırma beş ana analitik ve biyolojik katmanı birleştirmektedir:

1. Kapsamlı kimyasal profil: QZTBD’deki mümkün olduğunca fazla bileşenin UPLC-Q-TOF-MS^E ile belirlenmesi.
2. Serum maruziyet analizi: Sıçan serumunda değişmeden bulunan prototip bileşenlerin seçilmesi.
3. Mikrobiyota dönüşüm taraması: Prototip olarak serumda bulunmayan bileşenlerin antibiyotik deneyi ve insan dışkı mikrobiyotası inkübasyonuyla değerlendirilmesi.
4. Hedefli nicel analiz: Seçilmiş 15 bileşenin LC-MS/MS-MRM yöntemiyle eş zamanlı ölçülmesi.
5. Farmakodinamik doğrulama: Gut benzeri fare modelinde mikrobiyota azaltılmasının QZTBD etkisini değiştirip değiştirmediğinin incelenmesi.

Şekil 6A bu iş akışını görsel olarak özetlemektedir. Formülde bulunan bileşenler önce prototip emilenler ve prototip emilmeyenler olarak ayrılmakta; ikinci grup, canlı sıçan dışkısı karşılaştırması ve laboratuvar ortamındaki insan mikrobiyotası inkübasyonuyla yeniden süzülmektedir.

UPLC-Q-TOF-MS^E neden kullanıldı?

UPLC, bileşenleri kolonda ayırırken Q-TOF kütle spektrometresi iyonların yüksek doğrulukla kütle/yük oranını ölçmektedir.

Çalışmanın mantığını açıklamak için kütle spektrometrisindeki temel ilişki şöyle gösterilebilir:

\[ m/z = \frac{\text{iyonun kütlesi}}{\text{iyonun yük sayısı}} \]

• m, iyonun kütlesini,
• z, iyonun elektriksel yükünü ifade eder.

MS^E alımında düşük ve yüksek çarpışma enerjisi verileri aynı analiz içinde elde edilir. Düşük enerjili veri ana iyonu, yüksek enerjili veri ise parçalanma ürünlerini göstermeye yardımcı olur.

Bu özellik karmaşık karışımlarda yararlıdır; çünkü yalnızca moleküler kütleye değil, parçalanma davranışına da bakılarak yapı önerisi geliştirilebilir.

UPLC-Q-TOF-MS^E koşulları

221 bileşenin kimyasal dağılımı

Kütle hatalarının önerilen öncül iyonlar için ±5 ppm içinde kaldığı belirtilmiştir. Bu doğruluk, yapı önerilerini destekler; ancak aynı moleküler formüle sahip izomerlerin yalnızca doğru kütleyle kesin olarak ayırt edildiği anlamına gelmez.

Referans standartla karşılaştırılan bileşenler daha güçlü biçimde doğrulanmış, diğer bileşenlerin önemli bir bölümü doğru kütle, parçalanma deseni, veri tabanı ve literatür karşılaştırmasıyla geçici olarak açıklanmıştır.

Şekil 1’deki kromatogramlar ne gösteriyor?

Şekil 1’de QZTBD örneğinin pozitif ve negatif iyon modlarındaki baz pik yoğunluğu kromatogramları ile referans standart çözeltisinin kromatogramları birlikte gösterilmektedir.

QZTBD kromatogramlarında analiz süresine yayılmış çok sayıda pik bulunması, formülün kimyasal çeşitliliğini göstermektedir. Referans standart kromatogramları daha az ve belirgin pikler içerir. Bu karşılaştırma, belirli hedef bileşenlerin karmaşık formül içindeki alıkonma bölgelerini desteklemek amacıyla kullanılmıştır.

Flavonoidlerin parçalanma davranışları

Şekil 2’de luteolin, diosmin, astilbin ve engeletinin MS/MS spektrumları ve önerilen parçalanma yolları sunulmaktadır.

Luteolin

Luteolin negatif iyon modunda m/z 285,0416 [M−H]⁻ öncül iyonu vermiştir. m/z 151,0040 ve 133,0298 iyonları flavon iskeletindeki Retro-Diels–Alder parçalanmasıyla ilişkilendirilmiştir.

Diosmin

Diosmin m/z 607,1671 [M−H]⁻ iyonu göstermiştir. m/z 299,0561 ürünü, rutinoz grubunun uzaklaşmasıyla oluşan diosmetin aglikonuyla ilişkilendirilmiştir.

Astilbin

Astilbin m/z 449,1098 [M−H]⁻ öncül iyonunu oluşturmuştur. Ramnoz kaybından sonra m/z 303,0518 taxifolin aglikon iyonu; ardından su kaybıyla m/z 285,0413 ve RDA parçalanmasıyla m/z 151,0040 iyonları gözlenmiştir.

Engeletin

Engeletinde ramnoz kaybı sonrasında m/z 287,0561 aglikon iyonu, su kaybıyla m/z 269,0459 ve devam eden RDA parçalanmaları bildirilmiştir.

Bu parçalanmalar, flavonoid glikozitlerde şeker grubunun ayrılmasının yapı tanımlamasında nasıl tanısal bilgi sağladığını göstermektedir.

Alkaloidlerin parçalanma davranışları

Şekil 3 palmatine, dehydrocorydaline, corydaline ve D-tetrahydropalmatine için pozitif iyon modundaki parçalanma desenlerini göstermektedir.

• Palmatine: m/z 352,1542 [M]⁺ öncül iyonundan CH₄ ve CO kayıplarıyla m/z 336,1228 ve 308,1279 iyonları oluşmuştur.
• Dehydrocorydaline: m/z 366,1703 [M]⁺ iyonundan m/z 350,1393, 322,1441 ve 306,1136 ürünleri bildirilmiştir.
• Corydaline: m/z 370,2014 [M+H]⁺ öncül iyonundan m/z 354,1703 ve tanısal m/z 192,1019 iyonu oluşmuştur.
• D-tetrahydropalmatine: m/z 356,1861 [M+H]⁺ iyonu; m/z 324,1237, 192,1020 ve 176,0708 ürünlerini vermiştir.

Araştırmacılar bu alkaloidlerin özellikle Yanhusuo bitkisiyle ilişkili olduğunu ve formülün olası ağrı ile inflamasyon bağlantılı bileşenleri arasında değerlendirilebileceğini tartışmıştır. Ancak bu çalışmada söz konusu alkaloidler tek başlarına ağrı deneyinde sınanmamıştır.

Diğer yapı sınıflarından örnekler

Şekil 4’te üç farklı yapı sınıfı gösterilmektedir:

• Sweroside: İridoid glikozit; m/z 359,1341 [M+H]⁺ ve glikoz kaybıyla m/z 197,0807.
• Dioscin: Steroidal saponin; m/z 869,4903 [M+H]⁺ ve ardışık şeker kayıplarıyla m/z 723,4312, 577,3742 ve 415,3211.
• Oxypeucedanin hydrate: m/z 305,1021 [M+H]⁺; C₅H₁₀O₂ kaybıyla m/z 203,0341 ve devamında m/z 147,0340.

Serumda prototip maruziyet nasıl belirlendi?

QZTBD verilen sıçanların serum profilleri kontrol serumuyla karşılaştırılmıştır. Bir bileşenin prototip olarak emildiğinin kabul edilmesi için temel ölçütler şunlardır:

• İlaç verilen serumda bulunması ve boş serum yanıtının en az iki katına ulaşması,
• QZTBD ekstraktındaki ilgili bileşenle uyumlu alıkonma zamanı,
• Doğru kütle ve moleküler formül uyumu,
• Benzer MS/MS parçalanma davranışı.

Şekil 5’teki serum kromatogramı, özgün QZTBD ekstraktındaki çok yoğun pik yapısına kıyasla daha sınırlı sayıda tanımlanmış prototip bileşen göstermektedir.

42 prototip bileşen hangi sınıflardan oluştu?

• 10 terpenoid,
• 9 alkaloid,
• 8 flavonoid,
• 5 fenol,
• 4 kumarin,
• Birer organik asit, karbonhidrat, amino asit, steroid, antrakinon ve saponin.

Serum maruziyeti, farmakolojik ilgi ve referans standart bulunabilirliği dikkate alınarak sekiz prototip temsilci seçilmiştir:

• Corydaline,
• D-tetrahydropalmatine,
• Palmatine,
• Astilbin,
• Luteolin,
• Oxypeucedanin hydrate,
• Proline betaine,
• Dioscin.

Antibiyotikle mikrobiyota azaltma deneyi

Serum ve dışkı bileşen analizi için 24 erkek SD sıçan dört gruba ayrılmıştır; her grupta altı hayvan bulunmaktadır:

Antibiyotik kokteyli 14 gün boyunca içme suyunda şu maddeleri içermiştir:

• Vancomycin: 0,5 g/L,
• Ampicillin: 0,1 g/L,
• Neomycin: 1,0 g/L,
• Metronidazole: 1,0 g/L.

Ek görselde normal ve antibiyotik uygulanmış sıçan ile fare dışkı örneklerinin kültür plakaları karşılaştırılmaktadır. Normal gruplarda yoğun koloni oluşumu görülürken antibiyotik gruplarında belirgin azalma bulunmaktadır. Bu, kültüre alınabilen bakterilerin azaldığını destekler; bağırsak ortamının tamamen steril hâle geldiğini göstermez.

Neden antibiyotik grubunda artan dışkı bileşenleri önemli?

Normal mikrobiyota bir ana bileşeni tüketiyor veya başka ürüne dönüştürüyorsa, antibiyotikle bu işlem azaltıldığında ana bileşen dışkıda daha fazla kalabilir.

Bu mantık şöyle özetlenebilir:

\[ \text{Normal mikrobiyota: ana bileşen} \rightarrow \text{tüketim veya dönüşüm} \]

\[ \text{Mikrobiyota azaldığında: daha fazla dönüşmemiş ana bileşen} \]

Çalışmada 19 bileşenin ABX + QZTBD grubunun dışkısında normal QZTBD grubuna göre arttığı belirlenmiştir. Ancak artışın nedeni yalnızca mikrobiyal dönüşüm olmayabilir; bağırsak hareketleri, emilim, antibiyotiklerin konak metabolizmasına etkisi veya dışkı bileşimi de sonucu etkileyebilir.

Gut hastalarından alınan dışkı mikrobiyotasıyla in vitro deney

İnsan dışkı örnekleri 25–47 yaşlarında, gut artriti tanısı bulunan 62 erkek katılımcıdan alınmıştır. Katılımcılardan bilgilendirilmiş onam alındığı ve insan araştırmasının etik kurul tarafından onaylandığı belirtilmiştir.

Dışkı süspansiyonu hazırlığında:

• 200 mg dışkı 800 µL steril PBS içinde süspanse edilmiştir.
• Büyük parçacıklar 800 × g’de, 4°C’de üç dakika santrifüjle uzaklaştırılmıştır.
• Bakteri süspansiyonu BHI ortamıyla 3 × 10⁹ CFU/mL düzeyine ayarlanmıştır.

Üç inkübasyon grubu kurulmuştur:

Örnekler yüzde 80 N₂, yüzde 10 H₂ ve yüzde 10 CO₂ içeren anaerobik ortamda 37°C’de 72 saat inkübe edilmiştir.

Mikrobiyota bulunan grupta dokuz ana bileşenin sinyali mikrobiyotasız kontrole göre anlamlı biçimde azalmıştır. Bu azalma söz konusu bileşenlerin mikroorganizmalar tarafından tüketilmiş veya dönüştürülmüş olabileceğini desteklemektedir.

Bu dokuz bileşen mikrobiyal metabolit midir?

Hayır. Çalışmada özellikle bu ayrım yapılmaktadır. Dokuz bileşen, bağırsak mikrobiyotasına yanıt veren potansiyel ana bileşenlerdir.

Çalışma:

• Oluşan yeni metabolitlerin moleküler yapısını belirlememiştir.
• Hangi bakterinin hangi bileşeni dönüştürdüğünü göstermemiştir.
• Dönüşümden sorumlu enzimi tanımlamamıştır.
• Oluşan metabolitin emilip emilmediğini ölçmemiştir.
• Metabolitin ana bileşenden daha aktif olduğunu göstermemiştir.

Bileşen sinyalinin azalması; biyotransformasyon, mikrobiyal tüketim, kimyasal bozunma veya hücrelere bağlanma gibi birden fazla sürece bağlı olabilir. Mikrobiyotasız ortam kontrolü kendiliğinden bozunmayı kısmen ayırmaya yardımcı olsa da bütün mekanizmaları açıklamaz.

Neden dokuz adaydan yalnızca yedisi hedefli panele girdi?

Serumdan seçilen sekiz prototip bileşene, mikrobiyota taramasından gelen yedi bileşen eklenerek 15 bileşenlik nicel panel oluşturulmuştur.

Mikrobiyota taramasında belirlenen 3-caffeoylshikimic acid ile 5-O-caffeoylshikimic acid nihai 15 bileşen arasında yer almamaktadır. Çalışmanın seçim ölçütleri arasında referans standart bulunabilirliği bulunduğu için bu iki bileşenin hedefli nicel panele alınmaması bu ölçütle uyumludur.

Bu durum önemli bir sınırlılığı gösterir: analitik panel yalnızca biyolojik öneme göre değil, güvenilir referans standarda erişilebilmesine göre de şekillenmiştir.

Bitki eksiltme deneyleri neyi gösterdi?

Seçilmiş bileşenlerin hangi bitkiden kaynaklandığını değerlendirmek için QZTBD’nin tam formülünden tek bir bitkinin çıkarıldığı negatif kontrol dekoksiyonları hazırlanmıştır.

Çıkarılan bitkiler:

• Tufuling,
• Bixie,
• Yiyiren,
• Yanhusuo,
• Foshou’dur.

Şekil 6E’deki ısı haritasına göre:

• Astilbinin ana kaynağı Tufuling olarak belirlenmiştir.
• Corydaline, D-tetrahydropalmatine ve dehydrocorydaline gibi alkaloidlerin temel katkıcısı Yanhusuo’dur.
• Proline betaine ve bazı narenciye ilişkili flavonoidler Foshou çıkarıldığında azalmıştır.
• Bazı flavonoidler ve glikozitler tek bir bitkiye özgü belirgin desen göstermemiştir.

Bir bileşenin tek bitki çıkarıldığında azalması o bitkinin önemli kaynak olduğunu destekler; bileşiğin yalnızca o bitkide bulunduğunu kesin olarak göstermez. Birden fazla bitki aynı veya benzer bileşiği sağlayabilir.

Hedefli LC-MS/MS yönteminin amacı

UPLC-Q-TOF-MS^E yüzlerce bileşeni geniş kapsamlı biçimde taramak için kullanılmıştır. Buna karşılık üçlü kuadrupol LC-MS/MS sistemi seçilmiş bileşenleri daha seçici ve nicel biçimde ölçmek amacıyla kullanılmıştır.

MRM yönteminde ilk kuadrupol belirli bir öncül iyonu seçer, çarpışma hücresinde iyon parçalanır ve üçüncü kuadrupol belirli bir ürün iyonunu izler. Böylece her bileşen için “öncül iyon → ürün iyon” geçişi analitik parmak izi gibi kullanılabilir.

LC-MS/MS analiz koşulları

15 bileşen için MRM geçişleri

Yöntem validasyonu nasıl yapıldı?

Hedefli LC-MS/MS yöntemi şu ölçütlerle değerlendirilmiştir:

• Özgüllük: Karma standart, QZTBD örneği ve boş çözücü kromatogramlarının karşılaştırılması.
• Doğrusallık: Pik alanının analit derişimine karşı grafiğe geçirilmesi.
• LOQ: Güvenilir nicel ölçüm yapılabilen en düşük düzeyin değerlendirilmesi.
• Cihaz kesinliği: Aynı çözeltinin art arda altı kez enjeksiyonu.
• Gün içi kesinlik: Aynı gün içindeki tekrar analizleri.
• Günler arası kesinlik: Üç ardışık gündeki analizler.
• Tekrarlanabilirlik: Aynı örneğin bağımsız hazırlanan altı tekrarı.
• Geri kazanım: Düşük, orta ve yüksek düzeyde standart ekleme.
• Kararlılık: Aynı örneğin 0, 2, 4, 8, 12 ve 24 saat sonra yeniden analizi.

Çalışmada geri kazanım şu formülle hesaplanmıştır:

\[ \text{Geri kazanım (\%)} = \frac{\text{ölçülen toplam miktar} - \text{başlangıç miktarı}} {\text{eklenen standart miktarı}} \times 100 \]

Yazarlar yöntemin doğrusallık, duyarlılık, kesinlik, tekrarlanabilirlik, geri kazanım ve kararlılık bakımından tatmin edici olduğunu bildirmiştir. Ancak her analite ait bütün sayısal validasyon değerleri ana metinde tek tek verilmemiş; ayrıntılar ek tablolara yönlendirilmiştir.

15 örnekte ölçülen miktar aralıkları

Aşağıdaki aralıklar Tablo 2’de sunulan 15 QZTBD örneğinin en düşük ve en yüksek ortalama değerlerinden çıkarılmıştır. Birimler µg/g’dir ve bütün QZTBD üretimleri için evrensel spesifikasyon olarak yorumlanmamalıdır.

Bu geniş değişim, karmaşık bitkisel formüllerde yalnızca bir veya iki yüksek miktarlı belirtecin kullanılmasının bütün kimyasal yapıyı temsil etmeyebileceğini göstermektedir.

En bol bileşen en önemli bileşen midir?

Hayır. Astilbinin miktarı bazı örneklerde yüzlerce µg/g düzeyindeyken bazı alkaloidler 1 µg/g’ın altında bulunmuştur. Buna rağmen düşük miktarlı bir bileşen yüksek biyolojik etkinlik gösterebilir veya kolay emilebilir.

Çalışmanın önerdiği panel bu nedenle yalnızca miktara göre oluşturulmamıştır. Seçimde:

• Kimyasal sınıf,
• Polarite,
• Serumda prototip maruziyet,
• Mikrobiyotayla dönüşüm olasılığı,
• Farmakolojik ilgi,
• Referans standart bulunabilirliği birlikte değerlendirilmiştir.

Farmakodinamik fare deneyinin tasarımı

Toplam 30 erkek C57BL/6J fare beş gruba ayrılmıştır; her grupta altı fare bulunmaktadır:

Model gruplarına yüksek yağlı diyet verilmiş ve sağ arka ayak tabanına her 10 günde bir 40 µL PBS içinde 1 mg monosodyum ürat kristali enjekte edilmiştir. Tedavi altı hafta sürmüştür.

Hangi sonuçlar ölçüldü?

• Serum ürik asit düzeyi,
• Serum kreatinin düzeyi,
• TNF-α,
• IL-6,
• IL-1β,
• NLRP3,
• Ayak şişliği indeksi,
• Von Frey filamentleriyle mekanik ağrı eşiği,
• Karaciğer organ indeksi,
• Böbrek organ indeksi.

Ayak şişliği indeksinin çalışmadaki temel anlamı şöyledir:

\[ \text{Ayak şişliği indeksi} = \frac{\text{sağ ayak tabanı ölçümü}} {\text{sol ayak tabanı ölçümü}} \]

Sağ ayak MSU enjeksiyonu yapılan taraftır. Oranın yükselmesi sağ taraftaki şişmenin arttığını gösterir.

Şekil 7 ne anlatıyor?

Şekil 7 çok panelli olarak bütün farmakodinamik deneyin sonuçlarını sunmaktadır:

• Model grubunda serum ürik asidi yükselmiştir.
• QZTBD uygulaması ürik asit düzeyini düşürmüştür.
• Serum kreatininindeki model ilişkili artış QZTBD ile azalmıştır.
• TNF-α, IL-6, IL-1β ve NLRP3 sonuçları inflamasyonun QZTBD ile baskılandığını desteklemiştir.
• Ayak şişliği ve mekanik allodini QZTBD grubunda iyileşmiştir.
• Antibiyotik + QZTBD grubundaki iyileşme yalnızca QZTBD grubuna göre daha zayıf kalmıştır.
• Karaciğer ve böbrek organ indekslerinde belirgin olumsuz değişiklik görülmemiştir.

Antibiyotik sonrasında etkinin zayıflaması, QZTBD’nin etkisinin en azından bir bölümünde bağırsak mikrobiyotasının rol oynadığını desteklemektedir. Ancak etki tamamen ortadan kalkmamıştır; dolayısıyla çalışma QZTBD’nin yalnızca mikrobiyota üzerinden etkili olduğunu söylememektedir.

Antibiyotik deneyi nedenselliği ne ölçüde gösteriyor?

ABX + QZTBD grubunun QZTBD grubundan daha zayıf yanıt vermesi mikrobiyota katkısı için önemli bir bulgudur. Bununla birlikte geniş spektrumlu antibiyotikler:

• Çok sayıda bakteri grubunu aynı anda azaltır,
• Bağırsak bariyerini değiştirebilir,
• Safra asidi ve enerji metabolizmasını etkileyebilir,
• İlaçların emilimini değiştirebilir,
• Konak bağışıklığı üzerinde doğrudan etki oluşturabilir.

Bu nedenle sonuç belirli bir bakteri veya metabolitin nedensel rolünü göstermez. Daha kesin sonuçlar için mikrobiyota transferi, tek bakteri kolonizasyonu, belirli enzim inhibitörleri veya tanımlanmış metabolit uygulamaları gerekir.

Geçmiş açısından çalışmanın önemi

Geleneksel serum farmakokimyası, formülden kana değişmeden geçen bileşenleri olası aktif maddeler için temel aday kabul eder. Bu yaklaşım dolaşıma giren prototipleri göstermek açısından değerlidir; ancak glikozit ve yüksek polariteli bileşiklerin çoğunu dışarıda bırakabilir.

Bu çalışma, serumda görünmeyen bileşenlerin bir bölümünü bağırsak mikrobiyotasıyla ilişkili ikinci bir analitik kanaldan değerlendirmiştir. Böylece “serumda yoksa ele” yaklaşımından daha geniş bir önceliklendirme çerçevesi önermiştir.

Bugün açısından önemi

Karmaşık bitkisel preparatların kalite kontrolünde genellikle kolay ölçülen veya yüksek miktarda bulunan birkaç belirteç seçilir. Bu belirteçler her zaman biyolojik maruziyeti temsil etmeyebilir.

Çalışmanın önerdiği ikili panel:

• Doğrudan emilen prototip bileşenleri,
• Bağırsak mikrobiyotasıyla dönüşmeye aday bileşenleri aynı nicel yöntemde bir araya getirmektedir.

Bu yaklaşım gelecekte botanik ürünlerde kalite kontrol belirteçlerinin yalnızca kimyasal bolluğa değil, biyolojik kullanım yoluna göre de seçilmesine katkı sağlayabilir.

Gelecek açısından hangi çalışmalar gerekiyor?

• Azalan dokuz ana bileşenden oluşan gerçek mikrobiyal metabolitler tanımlanmalıdır.
• Metabolitler yüksek çözünürlüklü hedeflenmemiş metabolomikle izlenmelidir.
• Dönüşümden sorumlu bakteri türleri ve enzimler belirlenmelidir.
• Karaciğer mikrozomları ve bağırsak hücresi metabolizması da taramaya eklenmelidir.
• Seçilmiş ana bileşenler ve metabolitler hayvanlarda tek tek uygulanmalıdır.
• Mikrobiyota dönüşümünün sistemik maruziyeti artırıp artırmadığı farmakokinetikle ölçülmelidir.
• İnsanlarda QZTBD kullanımı sonrasında serum, idrar ve dışkı metabolomikleri birlikte değerlendirilmelidir.
• Gut hastaları ile sağlıklı bireylerin mikrobiyal dönüşüm kapasitesi karşılaştırılmalıdır.
• Farklı yaş, cinsiyet, beslenme ve antibiyotik geçmişine sahip bireyler incelenmelidir.
• 15 bileşenli panel bağımsız laboratuvarlar ve farklı üretim partilerinde doğrulanmalıdır.

Gündelik yaşam ve sağlık açısından nasıl okunmalı?

Çalışma QZTBD’nin insanlar için kanıtlanmış bir gut tedavisi olduğunu göstermemektedir. Farmakodinamik veriler fare modelinden gelmektedir ve kullanılan QZTBD dozları doğrudan insan dozuna çevrilemez.

Çalışmanın gündelik yaşama daha genel katkısı, bağırsak mikrobiyotasının ağızdan alınan karmaşık ürünleri pasif biçimde geçiren bir ortam olmadığını göstermesidir. İnsanların bağırsak mikroorganizmaları aynı bitkisel bileşeni farklı biçimde dönüştürebilir. Bu durum gelecekte kişiden kişiye değişen yanıtların araştırılmasında önemli olabilir.

Ancak mevcut çalışma kişiler arası tedavi yanıtını, bireyselleştirilmiş dozu veya klinik başarıyı incelememiştir.

Çalışmanın güçlü yönleri

• Kimyasal profil, serum maruziyeti, dışkı analizi, insan mikrobiyotası inkübasyonu, hedefli nicel analiz ve farmakodinamik deney aynı çerçevede birleştirilmiştir.
• QZTBD’de 221 bileşen geniş kapsamlı olarak karakterize edilmiştir.
• Pozitif ve negatif iyon modları birlikte kullanılmıştır.
• Yapı önerileri doğru kütle ve MS/MS parçalanma yollarıyla desteklenmiştir.
• Serumda bulunan prototip bileşenlerle bulunmayan bileşenler açıkça ayrılmıştır.
• Mikrobiyota ilişkili taramada hem canlı sıçan karşılaştırması hem in vitro insan mikrobiyotası kullanılmıştır.
• Antibiyotik grubu, mikroorganizma varlığına ilişkin karşılaştırmalı araç sağlamıştır.
• Mikrobiyotasız ortam kontrolü kendiliğinden kimyasal değişimi ayırmaya yardımcı olmuştur.
• 15 bileşen geniş polarite ve yapı aralığını kapsamaktadır.
• Hedefli LC-MS/MS yöntemi çok sayıda validasyon ölçütüyle değerlendirilmiştir.
• Bitki eksiltme deneyleriyle bileşenlerin formül içindeki muhtemel kaynakları araştırılmıştır.
• Farmakodinamik deney bağırsak mikrobiyotasının QZTBD etkisine katkısını işlevsel düzeyde sınamıştır.
• Çalışma adayları “kesin aktif maddeler” veya “kanıtlanmış metabolitler” olarak değil, önceliklendirilen potansiyel bileşenler olarak sunmuştur.

Çalışmanın sınırlılıkları

• Çalışma hakem değerlendirmesinden geçmemiş bir preprinttir.
• 221 bileşenin tamamı referans standartla kesin olarak doğrulanmamıştır.
• Aynı moleküler kütleye sahip izomerler için geçici yapı ataması belirsizlik taşıyabilir.
• Serumda bulunmayan 179 bileşenden yalnızca dokuzu mikrobiyota dönüşüm adayı olarak önceliklendirilmiştir.
• Kalan 170 bileşenin karaciğer, bağırsak hücresi veya başka metabolik yolları değerlendirilmemiştir.
• Dışkıda ana bileşenin azalması oluşan metabolitin yapısını göstermez.
• Mikrobiyal metabolitlerin emilimi veya farmakokinetiği ölçülmemiştir.
• Metabolitlerin biyolojik etkinliği tek tek sınanmamıştır.
• Dönüşümden sorumlu bakteri türleri veya enzimler tanımlanmamıştır.
• Antibiyotik uygulaması belirli mikropları değil, mikrobiyal topluluğun geniş bölümünü değiştirmiştir.
• Antibiyotiklerin konak üzerindeki doğrudan etkileri tamamen dışlanamamıştır.
• İnsan dışkı çalışması yalnızca 25–47 yaşlarında erkek gut hastalarını kapsamıştır.
• Sağlıklı insan dışkı mikrobiyotasıyla karşılaştırma yapılmamıştır.
• İnsan dışkısı yalnızca in vitro inkübasyonda kullanılmıştır; insanlarda QZTBD tedavisi uygulanmamıştır.
• Farmakodinamik doğrulama fare modeline dayanmaktadır.
• Farelerdeki gut benzeri model insan gut hastalığının bütün özelliklerini temsil etmez.
• Seçilen 15 bileşenin hiçbiri etkinlik için tek başına uygulanmamıştır.
• 15 bileşenli panel referans standart bulunabilirliğinden etkilenmiştir.
• İki caffeoylshikimic acid adayı nicel panelin dışında kalmıştır.
• Validasyonun bütün analitlere ait ayrıntılı sayısal sonuçları ana metinde sunulmamıştır.
• QZTBD örnekleri arasında bazı bileşenlerin miktarı belirgin ölçüde değişmiştir.
• Karaciğer ve böbrek organ indekslerinin değişmemesi kapsamlı toksikolojik güvenlik kanıtı değildir.
• Uzun süreli toksisite, üreme toksisitesi veya insan güvenliği değerlendirilmemiştir.

Çalışma ne söylüyor?

• QZTBD’de 221 bileşen karakterize edilmiş veya geçici olarak açıklanmıştır.
• Bu bileşenlerin yalnızca 42’si sıçan serumunda prototip biçiminde saptanmıştır.
• Prototip serum analizi formüldeki bileşenlerin büyük bölümünü kapsamamaktadır.
• Antibiyotikle mikrobiyota azaltıldığında 19 bileşen dışkıda birikmiştir.
• Bu 19 bileşenden dokuzunun sinyali gut hastalarından elde edilen mikrobiyotayla inkübasyonda azalmıştır.
• Dokuz bileşen bağırsak mikrobiyotasıyla ilişkili dönüşebilir ana bileşen adayıdır.
• 15 temsilci bileşen aynı LC-MS/MS yönteminde ölçülebilmiştir.
• Astilbin, engeletin, quercitrin ve proline betaine görece yüksek miktarda bulunmuştur.
• QZTBD gut benzeri fare modelinde ürik asit, inflamasyon, şişlik ve ağrı göstergelerini iyileştirmiştir.
• Mikrobiyota azaltıldığında bu etkilerin bir bölümü zayıflamıştır.
• Bağırsak mikrobiyotası karmaşık bitkisel formüllerde potansiyel biyoaktif bileşen seçimine dahil edilebilir.

Çalışma ne söylemiyor?

• QZTBD’nin insanlarda klinik olarak kanıtlanmış bir gut tedavisi olduğunu göstermemektedir.
• Seçilen 15 bileşenin kesin aktif maddeler olduğunu kanıtlamamaktadır.
• Mikrobiyota tarafından oluşan metabolitlerin kimliklerini göstermemektedir.
• Dokuz ana bileşenin azalmasının yalnızca biyotransformasyondan kaynaklandığını kesinleştirmemektedir.
• Belirli bir bakteri türünün QZTBD etkisinden sorumlu olduğunu göstermemektedir.
• Bağırsak mikrobiyotası olmadan QZTBD’nin tamamen etkisiz olduğunu göstermemektedir.
• Farelerde kullanılan dozların insanlar için güvenli veya uygun olduğunu göstermemektedir.
• Organ indekslerinin değişmemesini tam güvenlik garantisi olarak sunmamaktadır.
• 15 bileşenli panelin bütün QZTBD ürünlerinde kalite standardı olduğunu göstermemektedir.
• İnsanlar arasındaki mikrobiyota farklılıklarına göre kişiselleştirilmiş tedavi önerisi sunmamaktadır.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

Deney gruplarının teknik özeti

Analitik eleme adımlarının sayısal özeti

Şekillerin temel bilimsel mesajları

Temel bulguların düzenli özeti

• UPLC-Q-TOF-MS^E ile 221 bileşen kimyasal sınıflarına ayrılmıştır.
• Kütle hataları ±5 ppm içinde tutulmuştur.
• Serumda prototip olarak yalnızca 42 bileşen bulunmuştur.
• 179 bileşen prototip serum analizinin dışında kalmıştır.
• Antibiyotik sonrası dışkıda 19 bileşen birikmiştir.
• İnsan gut mikrobiyotasıyla inkübasyonda bunların dokuzu azalmıştır.
• 15 temsilci bileşen için 28 dakikalık LC-MS/MS-MRM yöntemi kurulmuştur.
• Hedefler 0,013 µg/g’dan 315,430 µg/g’a uzanan geniş miktar aralığını kapsamıştır.
• QZTBD farelerde serum ürik asidi ve gut benzeri inflamatuvar bulguları azaltmıştır.
• Antibiyotik müdahalesi QZTBD’nin bu etkilerini kısmen zayıflatmıştır.
• Sonuçlar mikrobiyota dönüşümünü analitik önceliklendirmeye dahil etmenin uygulanabilir olduğunu göstermiştir.

Kaynak ve Yöntem Notu

Bu içerik, Xi Chen, Yi Zhao, Siyue Song, Fei Luo, Xixian Kong, Yu Lou, Ye Xu, Fusen Chen, Yanfang Bai, Kaiyue Shi, Yuqing Wang, Yutong Hua ve Tiejuan Shao tarafından hazırlanan “A microbiota-informed UPLC-Q-TOF-MS^E and LC-MS/MS strategy for prioritizing potential bioactive constituents from complex herbal formulas: Application to Qu-Zhuo-Tong-Bi decoction” başlıklı çalışmaya dayanmaktadır.

Çalışma karmaşık bir bitkisel formüldeki potansiyel biyolojik açıdan ilgili bileşenleri önceliklendirmek için yüksek çözünürlüklü kimyasal profil, sıçan serumu, sıçan dışkısı, antibiyotikle mikrobiyota azaltma, insan dışkı mikrobiyotasıyla in vitro inkübasyon, hedefli LC-MS/MS nicel analizi ve gut benzeri fare modelini birleştiren deneysel bir preprint araştırma makalesidir.

Metinde açıkça “This preprint research paper has not been peer reviewed” uyarısı bulunmaktadır. Dolayısıyla çalışma hakem değerlendirmesinden geçmemiştir. PDF’de hakemli bir dergi kabulü veya doğrulanmış nihai yayın bilgisi bulunmamaktadır.

Araştırma bir insan klinik tedavi çalışması değildir. İnsan katılımcılardan yalnızca dışkı örnekleri alınmış ve bu örneklerden elde edilen mikrobiyota laboratuvar ortamında QZTBD ile inkübe edilmiştir. İnsanlarda QZTBD verilmemiş, serum ürik asidi veya klinik gut sonucu ölçülmemiştir.

Farmakodinamik sonuçlar yüksek yağlı diyet ve MSU kristaliyle oluşturulmuş gut benzeri fare modeline dayanmaktadır. Farelerdeki etkiler insanlarda tedavi başarısı, doz güvenliği veya klinik etkinlik garantisi olarak yorumlanmamalıdır.

“Mikrobiyota tarafından dönüştürülebilir bileşen” ifadesi, ana bileşen sinyalinin antibiyotik ve in vitro inkübasyon karşılaştırmalarında değişmesine dayanmaktadır. Oluşan mikrobiyal metabolitler yapısal olarak tanımlanmamıştır.

UPLC-Q-TOF-MS^E ile açıklanan 221 bileşenin bir bölümü referans standartla doğrulanmış, geri kalanı doğru kütle, parçalanma deseni, veri tabanı ve literatür karşılaştırmasıyla geçici olarak atanmıştır.

Hedefli LC-MS/MS yöntemi 15 bileşeni aynı çalışmada ölçmek üzere doğrulanmıştır. Bununla birlikte her analite ait ayrıntılı doğrusal aralık, LOQ, RSD ve geri kazanım değerlerinin tamamı ana metinde yer almamakta; ek tablolara yönlendirilmektedir.

Hayvan deneyleri Zhejiang Chinese Medical University etik kurulu tarafından IACUC-20240219-15 numarasıyla; insan dışkı örneği çalışması 20240329-6 numarasıyla onaylanmıştır. Katılımcılardan bilgilendirilmiş onam alındığı belirtilmiştir.

Yazarlar çıkar çatışması bulunmadığını bildirmiştir. Çalışma National Natural Science Foundation of China, Zhejiang Provincial Natural Science Foundation ve Zhejiang Provincial Special Support Program for High-Level Talents tarafından desteklenmiştir.

Bu Türkçe makale yalnızca yüklenen PDF’deki deney protokolleri, kromatogramlar, parçalanma şemaları, tablolar, hayvan verileri ve yazarların tartışmasına dayanarak hazırlanmıştır. PDF’de bulunmayan klinik tedavi başarısı, kesin aktif madde, doğrulanmış mikrobiyal metabolit, insan güvenliği veya ticari ürün etkinliği iddiası eklenmemiştir.