Bu tədqiqat iki Afrika meyvə yarasası növünün Ebola virusu GP qlikoproteinini və ya Nipah virusu G qlikoproteinini ifadə edən rekombinant vaksinlərlə qarşılaşdıqda yaratdığı anticisim və gen ifadəsi cavablarını araşdıran eksperimental in vivo immunitet tədqiqatıdır. Tədqiqatçılar Eidolon helvum və Epomophorus gambianus növlərini müqayisə etmiş; anticisim bağlanmasını Luminex xMAP əsaslı multipleks mikrokürə immunoassayı ilə, anticisimlərin funksional neytrallaşdırma qabiliyyətini psevdotip virus neytrallaşdırma testi ilə və Ei. helvum-dakı molekulyar cavabı RNA sekvensləmə əsaslı transkriptomik analizlə qiymətləndirmişlər. Nipah vaksini yarasaların əksəriyyətində aydın anti-Nipah-G anticisim cavabı yaratdığı halda, Ebola GP-yə qarşı aydın bağlanma cavabı yalnız Ep. gambianus-da müşahidə edilmişdir. Buna qarşılıq Ei. helvum-da Ebola vaksini güclü seroloji artım yaratmasa da ISGylation, T-hüceyrə diferensiasiyası və əlaqəli immun yollarında nəzərəçarpacaq gen ifadəsi dəyişiklikləri görülmüşdür. Nəticələr növ və antigenə görə fərqli immun cavabların ola biləcəyini göstərir; lakin kiçik nümunə, Ep. gambianus-da yüksək heyvan itkisi, tək PBS transkriptomik nəzarəti və tədqiqatda canlı virus infeksiyası əvəzinə vaksin antigenlərindən istifadə olunması səbəbindən nəticələr real Ebola və ya Nipah infeksiyasının birbaşa qarşılığı kimi şərh edilə bilməz.

Tədqiqatın əsas problemi vəhşi təbiət sürveyansında yarasalardakı virusa-spesifik anticisimlərin çox vaxt keçmiş viral məruz qalmanın göstəricisi kimi istifadə olunması, lakin müxtəlif yarasa növlərində bu anticisimlərin nə qədər sürətlə yarandığının, nə dərəcədə funksional olduğunun və fərqli növlərin eyni antigenə eyni şəkildə cavab verib-vermədiyinin kifayət qədər bilinməməsidir. Bu qeyri-müəyyənlik yalnız seroloji pozitivliyə əsaslanaraq yarasanın müəyyən virusa yoluxduğunu, virusu daşıdığını və ya ötürə bildiyini söyləməyi çətinləşdirir.

Tədqiqatın ən öyrədici nəticələrindən biri antigenə bağlanan anticisimlə virusu neytrallaşdıran anticisimin eyni şey olmadığını göstərməsidir. Ebola vaksini tətbiq edilmiş Ep. gambianus fərdlərində Ebola GP-yə qarşı yüksək bağlanma siqnalları ölçülsə də, test edilən serumlar Ebola psevdotip virusunu təcrübənin ən aşağı serum durulaşdırmasında belə neytrallaşdırmamışdır. Buna görə yüksək seroloji siqnal təkbaşına qoruyucu və ya neytrallaşdırıcı immunitet demək deyil.

Tədqiqat niyə aparılmışdır?

Yarasalar müxtəlif zoonotik viruslarla əlaqələndirilir və sahədə virusun özünü aşkar etmək çox vaxt çətin olduğuna görə anticisim ölçülməsi geniş istifadə olunan epidemioloji alətdir. Lakin serum nümunəsində müəyyən viral zülala bağlanan anticisimin aşkarlanması təkbaşına infeksiyanın nə vaxt baş verdiyini, anticisimin nə qədər davam etdiyini, anticisimin virusu təsirsizləşdirə bildiyini və ya yarasanın virus üçün həqiqi rezervuar olduğunu göstərmir. Buna görə tədqiqatçılar nəzarətli eksperiment şəraitində müəyyən viral antigenlərə məruz qaldıqda iki fərqli Afrika meyvə yarasası növünün necə anticisim və gen ifadəsi cavabları yaratdığını görmək istəmişlər.

Tədqiqatda iki növ seçilmişdir. Eidolon helvum, saman rəngli Afrika meyvə yarasası kimi tanınan və henipaviruslarla əlaqəsi güclü şəkildə sənədləşdirilmiş növdür. Epomophorus gambianus isə Qambiya apoletli meyvə yarasasıdır və filoviruslarla mümkün əlaqəsinə görə tədqiqata daxil edilmişdir. İki növün coğrafi yayılmaları qismən üst-üstə düşsə də sahə seroloji tədqiqatları müxtəlif virus qruplarına qarşı fərqli anticisim nümunələri bildirmişdir. Tədqiqat bu müşahidələrin altında növə-spesifik immun fərqlərin olub-olmadığını sınamağa çalışır.

Bu Tədqiqatda Rekombinant Vaksinlər Niyə Canlı Ebola və ya Nipah Virusu Əvəzinə İstifadə Edildi?

Rekombinant vaksinlər canlı Ebola və ya Nipah virusu ilə təcrübə aparmaq üçün tələb olunan yüksək biotəhlükəsizlik şəraitinə müraciət etmədən yarasaların bu virusların əsas səth antigenlərinə qarşı immun cavabını nəzarətli şəkildə stimullaşdırmaq üçün istifadə edilmişdir. Bu yanaşma antigen məruz qalmasını araşdırmağa imkan verir; lakin həqiqi virusun hüceyrəyə girməsi, çoxalması, toxumalarda yayılması və xəstəlik yaratması kimi prosesləri ehtiva etmir və buna görə real infeksiyanın tam modeli deyil.

ChAdOx1 və MVA nə deməkdir?

ChAdOx1 şimpanze adenovirusundan hazırlanmış rekombinant viral vektordur. Buradakı vəzifəsi Ebola və ya Nipah virusunun özünü daşımaq deyil, seçilmiş viral qlikoproteinin genetik məlumatını sahib hüceyrələrə çatdırmaqdır. Hüceyrələr bu zülalı istehsal etdikdə immun sistemi yad antigeni tanıya və anticisimlə hüceyrəvi cavab yarada bilər.

MVA Modified Vaccinia Ankara sözlərinin qısaltmasıdır və başqa bir viral vektor kimi gücləndirici dozada istifadə edilmişdir. Ebola qrupunda ilk doza ChAdOx1-Ebola GP və dörd həftə sonrakı gücləndirici doza MVA-Ebola GP şəklindədir. Nipah qrupunda isə ilk ChAdOx1 vektoru Nipah G antigenini daşımış, lakin texniki hazırlıq problemlərinə görə dörd həftə sonrakı MVA gücləndiricisi Nipah antigenini daşımamışdır. Bu fərq xüsusilə dörd həftədən sonrakı iki vaksin qrupunun birbaşa molekulyar müqayisəsini çətinləşdirdiyi üçün transkriptomik analiz ilk dozadan sonrakı ilk dörd həftə ilə məhdudlaşdırılmışdır.

Prime-boost strategiyası nədir?

Prime-boost yanaşmasında ilk doza immun sistemini hədəf antigenlə ilk dəfə qarşılaşdıraraq cavabı başladır; sonrakı gücləndirici doza eyni hədəfə yönəlmiş immun cavabı yenidən stimullaşdırır. Bu tədqiqatda ilk inyeksiya 0. həftədə, ikinci inyeksiya 4. həftədə edilmişdir. Qan nümunələri həftəlik toplanmış və təcrübə təxminən səkkiz həftə davam etmişdir.

Tədqiqata neçə yarasa daxil edildi?

Yarasalar iyun 2017-də Akkra, Qanadakı təbii tünek yerlərindən tutulmuşdur. Cəmi 75 yarasa tutulmuş, balalar və dişilər sərbəst buraxılmışdır. İlkin mərhələdə 27 yetkin erkək Ei. helvum və 33 yetkin erkək Ep. gambianus saxlanılmış; sağlamlıq və davranış müşahidəsindən sonra yekun eksperiment qrupuna 19 Ei. helvum və 14 Ep. gambianus daxil edilmişdir. Yalnız erkəklərin seçilməsi yaş və hamiləlik kimi fizioloji dəyişənləri azaltmağı məqsədləmişdir; bunun müqabilində tədqiqat nəticələrinin dişi yarasalara birbaşa ümumiləşdirilə bilməməsi mühüm məhdudiyyətdir.

Ep. gambianus əsarət şəraitinə gözlənilməz dərəcədə zəif uyğunlaşmışdır. Heyvanlar hər üç eksperiment qrupunda itirilmiş; dörd fərd ikinci inyeksiyaya qədər, yalnız üç fərd səkkiz həftəlik eksperimentin sonuna qədər yaşamışdır. Mənbə tədqiqat bu itkiləri vaksin inyeksiyaları ilə əlaqələndirmir. Bu vəziyyət nümunə ölçüsünü ciddi şəkildə azaltmış, mümkün sağqalma qərəzi yaratmış və tədqiqatçıların Ep. gambianus məlumatlarına statistik test tətbiq etməməsinə səbəb olmuşdur.

Serologiya nəyi ölçür?

Serologiya serumdakı anticisimlərin araşdırılmasıdır. Tədqiqatçılar Luminex xMAP əsaslı multipleks mikrokürə immunoassayından, yəni MIA-dan istifadə etmişlər. Müxtəlif viral zülallar fərqli mikrokürələrə bağlanır; serumdakı anticisimlər tanıdıqları antigenlərə bağlandıqda flüoresan siqnal yaranır. Nəticə MFI, median fluorescence intensity, yəni median flüoresans intensivliyi kimi qeydə alınır.

MFI birbaşa “bu qədər milliqram anticisim var” formasında mütləq anticisim konsentrasiyası deyil. İstifadə edilən eksperiment sistemi daxilində antigenə bağlanan anticisim siqnalının nisbi ölçüsüdür. Buna görə yüksək MFI daha güclü antigen bağlanması ilə uyğun gəlir; lakin anticisimin mütləq virusu neytrallaşdırdığı anlamına gəlmir.

Paneldə səkkiz rekombinant viral qlikoprotein antigeni olmuşdur: Cedar virusu F və G, Hendra virusu F və G, Nipah virusu F və G, Ebola virusu GP və Marburg virusu GP. Müsbət nəzarətlərdə Ebola GP üçün 5D2, Marburg üçün 2B8, Hendra/Nipah G üçün 102.4 və Cedar üçün 14F3 monoklonal anticisimlərinin ardıcıl durulaşdırmaları istifadə edilmişdir. Mənfi nəzarət quyularında serum olmamışdır.

Cəmi 413 serum nümunəsi MIA ilə duplikat olaraq test edilmişdir. On üç ölçmə uğursuz olmuş; 100-dən az mikrokürə verən 12 nümunə keyfiyyət nəzarətindən sonra çıxarılmışdır. MFI məlumatlarına \(\log_{10}\) çevrilməsi tətbiq edilmişdir. Duplikatlar arasında 0,5 log vahiddən çox fərq göstərən az sayda nümunə işarələnmiş, lakin avtomatik xaric edilməmişdir.

Loqarifmik MFI dəyişimi necə oxunmalıdır?

Aşağıdakı ifadə tədqiqatın yeni tənliyi deyil; məqalədə istifadə olunan log-çevrilmiş MFI dəyişiminin riyazi mənasını izah etmək üçün verilmişdir:

\[ \Delta \log_{10}(\mathrm{MFI})= \log_{10}(\mathrm{MFI}_{final})- \log_{10}(\mathrm{MFI}_{initial}) \]

Burada \(\mathrm{MFI}_{initial}\) başlanğıcdakı, \(\mathrm{MFI}_{final}\) isə sonrakı zaman nöqtəsindəki flüoresans intensivliyidir. Loqarifm istifadə olunduğuna görə dəyişikliklər multiplikativ miqyasda oxunur. Məsələn, 1,0 \(\log_{10}\) vahid artım riyazi olaraq MFI-nin başlanğıca nisbətən 10 dəfə artmasına uyğun gəlir. Bu, anticisim konsentrasiyasının mütləq tam 10 dəfə artdığı anlamına gəlmir; MFI eksperiment sisteminin nisbi flüoresans ölçüsüdür.

MFI və Neytrallaşdırma Testi Eyni Şeyi Ölçür?

Xeyr. MFI testi anticisimlərin müəyyən viral antigenə bağlanmasını ölçdüyü halda, neytrallaşdırma testi bu serumun viral giriş mexanizmini funksional olaraq bloklayıb-bloklamadığını qiymətləndirir. Anticisim viral zülala güclü bağlana bilər, lakin virusun hüceyrəyə girişini dayandırmayan epitopu tanıya bilər; buna görə yüksək MFI ilə yüksək neytrallaşdırma qabiliyyəti mütləq eyni nəticə deyil.

Psevdotip virus nədir?

Psevdotip virus tədqiq edilən virusun giriş zülalını səthində daşıyan, lakin tədqiqatın hədəfindəki tam patogen virusun özü olmayan laboratoriya test sistemidir. Bu tədqiqatda ikinci nəsil, üç plazmidli lentiviral sistem istifadə edilmiş və müxtəlif filovirus və ya henipavirus qlikoproteinlərini daşıyan psevdotiplər hazırlanmışdır. Beləliklə serumun xüsusilə viral giriş zülalını hədəfləyən neytrallaşdırma qabiliyyəti ölçülə bilmişdir.

Serumlar üçqat ardıcıl durulaşdırmalarla 1:50 ilə 1:12.150 arasında hazırlanmışdır. Psevdotip virus 100 × TCID50 səviyyəsində serumla bir saat 37 °C-də inkubasiya edilmiş, sonra müvafiq hüceyrə xəttindən \(2\times10^4\) hüceyrə əlavə edilmiş və 48 saatlıq inkubasiyadan sonra lusiferaza siqnalı ölçülmüşdür.

TCID50 hüceyrə kulturası sistemində nümunələrin faiz 50-sində infeksiya yarada bilən dozanın eksperimental ölçüsüdür. IC50 isə burada serumun psevdotip virus siqnalını faiz 50 azalda bildiyi durulaşdırmanı ifadə edir. Daha yüksək neytrallaşdırıcı titr serumun daha çox durulaşdırılmış halda belə təsirini davam etdirə bildiyini göstərir.

Nipah vaksininə anticisim cavabı

Ei. helvum Nipah vaksin qrupunda bir fərd istisna olmaqla anti-Nipah-G bağlanma siqnalı yüksəlmişdir. Ebola və PBS qrupları nəzarət kimi birləşdirildikdə, ilk və son nümunə arasındakı anti-Nipah-G dəyişimi Nipah qrupunda əhəmiyyətli dərəcədə yüksəkdir: Wilcoxon sıra cəmi testi üçün \(W=76\), \(p=0{,}0026\).

İkinci inyeksiyadan əvvəl də fərq aydındır. İlk nümunə ilə gücləndiricidən əvvəlki son nümunə arasında median dəyişiklik Nipah qrupunda +1,0 \(\log_{10}\) MFI vahidi, Ebola qrupunda −0,5 və PBS qrupunda 0,0 kimi bildirilmişdir. Bu müqayisədə \(W=77\) və \(p=0{,}0018\)-dir.

Bütün zaman sırasından istifadə edən xətti qarışıq təsirlər modelində vaksin qrupu və zaman sabit təsirlər, fərdi yarasa kimliyi isə təsadüfi təsir kimi götürülmüşdür. Qrup × zaman qarşılıqlı təsiri \(p<10^{-4}\) ilə Nipah vaksininin zaman daxilində təsirini dəstəkləmişdir. Təsadüfi fərd təsirindən istifadə eyni yarasadan həftələr boyunca götürülən ölçmələrin bir-birindən tam müstəqil olmadığını modelə daxil etmək üçün vacibdir.

Başlanğıcdakı Nipah-G MFI səviyyəsi ilə eksperiment boyunca müşahidə olunan dəyişiklik arasında mənfi korrelyasiya tapılmışdır. Bütün Ei. helvum fərdlərində Pearson \(r=-0{,}65\), %95 etibar intervalı \([-0{,}85,-0{,}28]\); yalnız Nipah vaksin qrupunda \(r=-0{,}90\), %95 etibar intervalı \([-0{,}98,-0{,}44]\) kimi bildirilmişdir. Bu əlaqə başlanğıcda daha yüksək siqnala malik fərdlərin daha kiçik xalis artım göstərməsi ilə uyğundur; korrelyasiya təkbaşına bunun səbəbini izah etmir.

Nipah neytrallaşdırma analizində 14 son dövr serum nümunəsi istifadə edilmişdir. MIA ölçümü ilə psevdotip neytrallaşdırma nəticəsi arasında güclü müsbət əlaqə aşkarlanmışdır: Spearman \(\rho=0{,}82\), \(p=0{,}0003\), \(n=14\). Tədqiqat nümunəsində MFI dəyəri təxminən 200 vahiddən yuxarı olan serumlarda neytrallaşdırıcı aktivlik görülmüşdür. Tədqiqatçılar əlavə olaraq əvvəlki bir tədqiqatda Ei. helvum Nipah-G serologiyası üçün ROC analizinə əsaslanan 500 MFI həddinin təklif edildiyini bildirirlər. Buna görə 200 və 500 MFI dəyərləri eyni məqsədlə yaradılmış universal hədlər kimi qiymətləndirilməməlidir.

Eksperimentin sonunda Nipah vaksin qrupunda neytrallaşdırma testi aparılan səkkiz yarasanın hamısında aşkarlana bilən neytrallaşdırıcı anticisim tapılmışdır.

Ebola vaksininə anticisim cavabı

Eidolon helvum-da Ebola vaksinindən sonra anti-Ebola-GP anticisim bağlanmasında ardıcıl artım müşahidə edilməmişdir. Buna qarşılıq ilk Ebola vaksinindən sonra ən az bir həftə yaşayan dörd Ep. gambianus fərdində Ebola GP MFI dəyərlərində böyük artımlar görülmüşdür. Lakin heyvan sayı çox az olduğuna görə bu növdə statistik test aparılmamışdır.

Tədqiqatın bu nöqtədəki ən mühüm fərqləndiricisi neytrallaşdırma eksperimentidir. Eksperimentin son günündə alınmış 15 serum nümunəsi Ebola GP daşıyan lentiviral psevdotiplə test edilmişdir. Bunlara Ebola qrupundakı səkkiz Ei. helvum, PBS qrupundakı dörd Ei. helvum və tədqiqatı tamamlayan üç Ep. gambianus serumu daxil olmuşdur. Heç bir nümunə ən aşağı 1:50 serum durulaşdırmasında Ebola psevdotipini neytrallaşdırmamışdır.

Tədqiqatçılar Ebola GP1 zülalının güclü qlikozilləşmiş musin bölgəsinin anticisim bağlanmasına təsir göstərə biləcəyi ehtimalını da araşdırmış və musin bölgəsi çıxarılmış Ebola GP1 psevdotipi ilə testi təkrarlamışlar. Buna baxmayaraq serumların heç biri 1:50 durulaşdırmada neytrallaşdırma göstərməmişdir.

Bu nəticə xüsusilə Ep. gambianus-da ölçülmüş yüksək Ebola-GP bağlanma siqnalının avtomatik olaraq neytrallaşdırıcı anticisim demək olmadığını göstərir. Müəlliflər bu anticisimlərin neytrallaşdırma təmin etməyən GP epitoplarını tanıya biləcəyini müzakirə edirlər. Anticisimlərin faqositoz və ya təbii öldürücü hüceyrə aktivləşməsi kimi Fc vasitəli başqa funksiyalara malik olub-olmadığı bu təcrübədə test edilməmişdir.

Vaksin vektorunun hüceyrələrə girə bilməməsi izah ola bilərmi?

Tədqiqatçılar hər iki vaksin vektorunun da Ei. helvum və Ep. gambianus hüceyrələrini in vitro flüoresans infeksiya təcrübəsində məlum həssas insan hüceyrələrinə bənzər effektivliklə yoluxdura bildiyini təsdiqləmişlər. Buna görə Ei. helvum-da Ebola GP-yə qarşı aydın serum anticisimi yaranmamasını yalnız adenoviral vektorun bu növün hüceyrələrinə girə bilməməsi ilə izah etmək tədqiqat məlumatları ilə dəstəklənmir.

Transkriptomik analiz nəyi araşdırır?

Transkriptom müəyyən hüceyrə və ya toxumada müəyyən anda ifadə olunan RNA molekullarının bütünüdür. Genin DNA-da mövcud olması ilə həmin genin o anda nə dərəcədə aktiv olması fərqli şeylərdir. RNA sekvensləmə hansı genlərdən nə qədər RNA istehsal olunduğunu təxmini kəmiyyətləndirərək immun sisteminin hansı molekulyar proqramlarının stimullaşdırıldığını araşdırmağa imkan verir.

Transkriptomik analiz yalnız Ei. helvum üzərində aparılmışdır. Başlanğıcda Ebola vaksin qrupundan 8, Nipah qrupundan 3 və PBS qrupundan 2 fərdin qan nümunələri seçilmişdir. Nəzarət fərdlərindən birinin yüksək başlanğıc anticisim profili və kənar transkriptomik davranışı səbəbindən diferensial gen ifadəsi analizindən çıxarılması nəticəsində qrup müqayisələri yalnız bir PBS nəzarətinə əsaslanmışdır. Bu vəziyyət nəticələrin statistik gücünü əhəmiyyətli dərəcədə məhdudlaşdırır.

Nipah qrupunun 4. həftədəki MVA gücləndiricisi Nipah antigenini daşımadığı üçün qruplar arasında mənalı müqayisəni qorumaq məqsədilə transkriptomik qiymətləndirmə yalnız ilk ChAdOx1 dozasından sonrakı ilk dörd həftə üzrə aparılmışdır.

RNA sekvensləmə necə aparılmışdır?

RNA, 150 µl tam qandan RNAzol BD üsulu ilə təcrid edilmişdir. Mənbə tədqiqat kiçik nümunə həcminə uyğunlaşdırılmış protokolu ətraflı verir: 300 µl RNAzol BD, 4,05 µl sirkə turşusu, 450 µl lizat, 22,5 µl 1-bromo-3-xloropropan, 78,75 µl izopropanol və 60–120 µl %75 etanol istifadə edilmiş; müvafiq mərhələdə 225 µl supernatant işlənmişdir.

RNA miqdarı NanoDrop 2000 ilə, RNA bütövlüyü Agilent 2100 Bioanalyzer ilə qiymətləndirilmişdir. Nümunələr Illumina platformasında 150 baza cütü uzunluğunda paired-end olaraq sekvenslənmişdir. Nümunə başına xam oxuma sayı orta hesabla \(26{,}25 \pm 3{,}02\) milyon kimi bildirilmişdir.

Keyfiyyət nəzarəti FastQC v0.11.4 ilə aparılmış, aşağı keyfiyyətli ardıcıllıqlar BBTools paketindəki bbduk.sh ilə kəsilmişdir. Həddən artıq təmsil olunan ardıcıllıqlar və adapterlər çıxarılmışdır. Qan transkriptlərinin təxminən %75-i hemoglobinə uyğun gəldiyi üçün bunlar məlumat dəstindən uzaqlaşdırılmışdır. Oxumaların soldakı ilk 10 bazası çıxarılmış; iki ucu orta Phred keyfiyyət balı ən az 10 olacaq şəkildə kəsilmiş və 25 bazadan qısa oxumalar atılmışdır. Bu əməliyyatlardan sonra nümunə başına orta hesabla \(6{,}82 \pm 3{,}08\) milyon oxuma qalmışdır.

Keyfiyyət filtrindən keçmiş oxumalar tədqiqat qrupu tərəfindən yaradılmış Ei. helvum qaralama genomuna STAR v2.7.3a ilə, --quantMode GeneCounts seçimi istifadə olunaraq hizalanmışdır. Kəsilmiş oxumaların %76–88-i genomda unikal mövqeyə uyğun gəlmişdir.

İkinci həftədəki PBS nümunəsinin RNA keyfiyyəti aşağı olduğuna görə həmin həftədə PBS ilə vaksin qrupları arasında diferensial ifadə müqayisəsi aparıla bilməmişdir.

Diferensial gen ifadəsi nədir?

Genin vaksin qrupunda nəzarət qrupuna nisbətən daha yüksək və ya daha aşağı səviyyədə ifadə olunmasına diferensial gen ifadəsi deyilir. Analiz DESeq2 v1.36.0 ilə aparılmış və çoxsaylı hipotez testlərindən yaranan yanlış müsbət nəticələri məhdudlaşdırmaq üçün Benjamini-Hochberg yanlış kəşf dərəcəsi, yəni FDR düzəlişi tətbiq edilmişdir. \(FDR<0{,}05\) olan genlər diferensial ifadə olunan gen, yəni DEG qəbul edilmişdir.

Diferensial ifadə çox vaxt \(\log_2\) qat dəyişimi ilə göstərilir. Aşağıdakı ifadə öyrədici riyazi açılımdır:

\[ \log_2 FC=\log_2\left(\frac{\mathrm{ifade}_{tedavi}} {\mathrm{ifade}_{karşılaştırma}}\right) \]

\(\log_2 FC=1\) riyazi olaraq ikiqat, \(\log_2 FC=-1\) yarı səviyyə, \(\log_2 FC=2\) dördqat ifadə nisbətinə uyğun gəlir. Lakin böyük qat dəyişimi təkbaşına bioloji əhəmiyyət sübutu deyil; nümunə ölçüsü, variasiya və çoxlu test düzəlişi də qiymətləndirilməlidir.

ISGylation Nədir və Bu Tədqiqatda Niyə Əhəmiyyətlidir?

ISGylation interferonla stimullaşdırılan ISG15 adlı ubiquitinəbənzər zülalın başqa zülallara fermentativ şəkildə bağlandığı hüceyrəvi tənzimləmə prosesidir. Tədqiqatda Ebola və Nipah vaksin qrupları müqayisə edildikdə UBA7, ISG15, HERC5 və USP18 kimi ISGylation ilə əlaqəli genlərin ifadələri fərqli olmuşdur; buna görə bu yol iki viral qlikoproteinə qarşı yaranan fərqli molekulyar immun cavabları anlamaqda əsas nəticələrdən biri olmuşdur.

Mənbə tədqiqatda təsvir olunan əsas ISGylation zəncirində ISG15 əvvəlcə E1 fermenti UBA7 tərəfindən aktivləşdirilir, sonra E2 fermenti UBE2L6-ya ötürülür və E3 fermenti HERC5 vasitəsilə hədəf zülala bağlanır. Tədqiqatın birinci həftə Ebola-Nipah birbaşa müqayisəsində UBA7 ən güclü diferensial genlərdən biri olmuş; ISG15, HERC5 və USP18 də əhəmiyyətli fərq göstərmişdir. Bu dörd genin ifadə səviyyəsi Ebola vaksin qrupunda Nipah qrupuna nisbətən daha aşağı olmuşdur. Lakin Ebola qrupu PBS nəzarəti ilə müqayisə edildikdə eyni zaman nöqtəsində bu genlərin hamısı əhəmiyyətli dərəcədə aşağı deyil; mənbədə yalnız UBA7-nin əhəmiyyətli şəkildə aşağı tənzimləndiyi bildirilir. Bu fərq mühümdür.

ISGylation bir çox kontekstdə tip I interferonla əlaqəli antiviral cavablarla bağlıdır. Lakin bu təcrübədə canlı virus çoxalması olmadığı üçün müşahidə olunan ISGylation ilə əlaqəli dəyişikliklər viral replikasiyanın sübutu deyil. Müəlliflər bunları ChAdOx1 vaksin vektoru və daşınan Nipah-G və ya Ebola-GP antigenlərinə qarşı yaranan immun aktivləşmə kontekstində şərh edirlər.

GO və KEGG analizləri nə edir?

Yüzlərlə ayrı-ayrı gen siyahısını şərh etmək çətindir. Gene Ontology, yəni GO analizi diferensial genlərin müəyyən bioloji proseslərdə gözləniləndən daha çox təmsil olunub-olunmadığını araşdırır. KEGG isə hüceyrəvi və molekulyar yolların təşkil olunmuş məlumat bazasıdır. Burada WebGestalt 2019 istifadə edilərək DEG siyahılarında müəyyən bioloji proseslərin və KEGG yollarının həddən artıq təmsil olunub-olunmadığı araşdırılmışdır.

Nipah vaksin qrupunun PBS ilə müqayisəsində həddən artıq təmsil olunan KEGG yolu və ya bioloji proses aşkarlanmamışdır. Ebola vaksin qrupunda isə leykosit diferensiasiyası ilə əlaqəli müxtəlif GO terminləri; Th1 və Th2 hüceyrə diferensiasiyası, Notch siqnallaşması və JAK/STAT kaskadı kimi immun sisteminin mühüm tənzimləyici yolları ilə əlaqəli siqnallar tapılmışdır.

Lakin tədqiqatçılar sitokin transkriptlərinin məhdud aşkarlanmasına görə hansı T-köməkçi hüceyrə alt tipinin üstün olduğunu müəyyən edə bilməmişlər. Buna görə “Ebola antigeninə qarşı anticisim yaranmadı, çünki immun sistemi hüceyrəvi cavaba keçdi” kimi qəti mexanizm tədqiqat tərəfindən sübut edilməmişdir.

Tədqiqatın Metodu və Nəticələri

Heyvanların saxlanması və nümunə götürülməsi

Təcrübəyə daxil edilən yarasalar 80 × 80 × 80 cm qəfəslərdə, eyni növdən ən çox beş fərdlik qruplar halında saxlanılmışdır. Qəfəslər təxminən 2 m aralı yerləşdirilmiş və sidik, ifrazat, qida və ya su vasitəsilə birbaşa və dolayı təması azaltmaq üçün metal baryerlərlə ayrılmışdır. Heyvanlara manqo, papaya və banan kimi doğranmış qarışıq meyvələr və sərbəst su verilmiş; gündəlik yenilənmişdir.

Yarasalar eksperimentdən əvvəl 8–10 gün baytar nəzarətində saxlanılmış, təcrübə boyunca stress, çəki itkisi və zədələnmə baxımından izlənmişdir.

İlk qan nümunəsi vaksinləşdirmədən əvvəl 0,5 ml olaraq götürülmüşdür. İlk inyeksiya əzələ daxilinə təxminən \(10^7\) IU ChAdOx1 və ya 0,25 ml PBS şəklində tətbiq edilmişdir. Dörd həftə sonra təxminən \(10^7\) pfu MVA və ya PBS tətbiq edilmişdir. Həftəlik qan nümunələrinin həcmi 0,3 ml-dir. Səkkizinci həftədə qalan heyvanlar venadaxili ketamin/medetomidin yüksək dozası ilə evtanaziya edilmiş və beyin, qaraciyər, dalaq, böyrək və mümkün olduqda limfa düyünü nümunələri toplanmışdır.

Serum nümunələri mümkün patogenləri inaktivləşdirmək məqsədilə 56 °C-də 30 dəqiqə qızdırılmış və nümunələr −80 °C-də saxlanılmışdır.

Əsas seroloji nəticələr

Transkriptomik məlumat emalının xülasəsi

Diferensial gen ifadəsinin sayısal nəticələri

PBS nəzarəti ilə hər zaman nöqtəsi ayrıca müqayisə edildikdə Ebola vaksin qrupunda diferensial ifadə olunan gen sayı 261 ilə 789 arasında dəyişmiş, orta hesabla \(506 \pm 266{,}0\) olmuşdur. Nipah vaksin qrupunda isə say yalnız 3 ilə 28 arasında dəyişmiş və orta hesabla \(16{,}3 \pm 12{,}6\) kimi bildirilmişdir.

Nipah qrupunda ən az bir zaman nöqtəsində diferensial ifadə olunan cəmi 38 genin 30-u Ebola qrupunda da ən az bir zaman nöqtəsində diferensial ifadə olunmuşdur. Bütün analizlər birlikdə qiymətləndirildikdə Ebola qrupuna xas 968, Nipah qrupuna xas 8 DEG bildirilmişdir.

Ebola və Nipah vaksin qrupları birbaşa müqayisə edildikdə ilk dörd həftədə DEG sayı 185 ilə 788 arasında dəyişmiş, orta hesabla \(405 \pm 282\) olmuşdur. Ən yüksək DEG sayları birinci və dördüncü həftələrdə görülmüşdür.

T-hüceyrə diferensiasiyası və JAK/STAT nəticələri

Ebola vaksin qrupunun PBS ilə müqayisəsində T-köməkçi hüceyrə diferensiasiyası ilə əlaqəli GO terminləri həddən artıq təmsil olunmuşdur. Th1 və Th2 diferensiasiyası ilə əlaqəli genlərlə yanaşı Notch və JAK/STAT siqnal yolları da önə çıxmışdır.

Th1 hüceyrələri ümumiyyətlə hüceyrədaxili patogenlərə qarşı immun cavablarla; Th2 hüceyrələri isə B-hüceyrə aktivləşməsi və humoral cavablarla əlaqələndirilir. Bununla belə tədqiqatda müvafiq sitokin RNA-larının məhdud aşkarlanması səbəbindən Ebola vaksininə məruz qalan Ei. helvum-da Th1 və ya Th2 istiqamətində üstün cavab müəyyən edilə bilməmişdir.

Buna görə seroloji anti-Ebola cavabının görünməməsini “immunitet tamamilə hüceyrəvi qola keçdi” şəklində izah etmək mənbə tərəfindən dəstəklənmir.

ISGylation yolundakı nəticələrin təfərrüatı

Ebola və Nipah vaksin qruplarının birinci həftə birbaşa müqayisəsində ən güclü DEG UBA7 olmuşdur. ISG15, HERC5 və USP18 də iki qrup arasında diferensial ifadə göstərmişdir. UBA7, ISG15, HERC5 və USP18-in ifadə səviyyələri Ebola qrupunda Nipah qrupuna nisbətən daha aşağı olmuşdur.

Burada iki fərqli müqayisəni bir-birinə qarışdırmamaq lazımdır. “Ebola qrupunda Nipah qrupuna nisbətən daha aşağı” nəticəsi avtomatik olaraq “Ebola qrupunda nəzarətdən aşağı” demək deyil. PBS ilə müqayisədə birinci həftədə bu dörd gendən yalnız UBA7-nin Ebola qrupunda əhəmiyyətli şəkildə aşağı tənzimləndiyi bildirilmişdir.

Eidolon helvum ilə Epomophorus gambianus Eyni Antigenlərə Eyni Cavabı Verdi?

Xeyr. Nipah G antigeninə qarşı hər iki növdə aydın anticisim cavabları görülə bildiyi halda, Ebola GP antigeninə qarşı güclü bağlanma cavabı yalnız az sayda sağ qalan Epomophorus gambianus fərdində görülmüş, Eidolon helvum-da isə ardıcıl anti-Ebola-GP serum anticisimi artımı aşkarlanmamışdır. Bununla belə Ei. helvum-dakı transkriptomik cavab Ebola vaksininə qarşı çoxsaylı gen və immun yolun dəyişdiyini göstərmişdir; buna görə “anticisim artımı yoxdur = immun cavab yoxdur” nəticəsi çıxarıla bilməz.

Tədqiqatın dəstəklədiyi nəticələr

• Nipah G antigenini daşıyan vaksin, xüsusilə Ei. helvum-da aydın və statistik olaraq dəstəklənən anti-Nipah-G anticisim artımı yaratmışdır.
• Nipah-G MIA siqnalı ilə psevdotip neytrallaşdırma aktivliyi arasında araşdırılan nümunələrdə güclü əlaqə tapılmışdır.
• Ep. gambianus-da Ebola GP-yə bağlanan anticisim siqnalı artmışdır; lakin bu nəticə çox kiçik heyvan sayına əsaslanır.
• Ebola GP-yə bağlanan serum anticisimləri test edilən şəraitdə Ebola psevdotipini neytrallaşdırmamışdır.
• Ei. helvum-da Ebola vaksini aydın serum anticisimi artımı yaratmasa da geniş transkriptomik cavabla əlaqələndirilmişdir.
• Ebola və Nipah vaksin qrupları arasında ISGylation, tip I interferon cavabı, virusa cavab və T-hüceyrə seçimi ilə əlaqəli gen və yollarda fərqlər görülmüşdür.
• Yarasa növlərinin eyni viral antigenlərə immun cavab vermə forması bir-birindən fərqli ola bilər.

Tədqiqatın dəstəkləmədiyi nəticələr

Tədqiqat Eidolon helvum və ya Epomophorus gambianus-un təbii mühitdə Ebola və ya Nipah virusunu hansı tezliklə daşıdığını ölçməmişdir. Vaksinə cavab vermək təbii rezervuar statusunu sübut etmir. Serumda anticisimin aşkarlanması aktiv infeksiya, canlı virus saçılması və ya yoluxduruculuq demək deyil.

Eksperimentdə canlı Ebola və ya Nipah virusu istifadə edilmədiyi üçün real infeksiya zamanı viral çoxalma, toxuma tropizmi, xəstəlik inkişafı və ya virus saçılması barədə birbaşa nəticə vermir.

Ep. gambianus-da Ebola GP-yə bağlanan anticisimlərin qoruyucu olduğu göstərilməmişdir. Əksinə istifadə olunan psevdotip neytrallaşdırma eksperimentində neytrallaşdırma aşkarlanmamışdır. Bununla yanaşı tədqiqat neytrallaşdırmayan anticisimlərin başqa immun funksiyalarını birbaşa test etməmişdir.

Ei. helvum-dakı geniş Ebola vaksini transkriptomik cavabı bu növün real Ebola infeksiyasına eyni şəkildə cavab verəcəyinin sübutu deyil. Vaksin vektoru və antigen təqdimatı ilə canlı viral infeksiya bioloji baxımdan eyni proses deyil.

Tədqiqat yalnız yetkin erkək yarasaları əhatə etdiyinə görə dişilərdə, balalarda və ya fərqli yaş qruplarında eyni nəticələrin yaranacağını göstərmir.

Əsas məhdudiyyətlər

Ən böyük məhdudiyyət Ep. gambianus fərdlərinin sürətlə itirilməsidir. Başlanğıcda 14 fərd olsa da yalnız dörd heyvan ikinci inyeksiyaya və üç heyvan eksperimentin sonuna çatmışdır. Bu vəziyyət həm statistik gücü azaltmış, həm də eksperimentin sonuna çatan heyvanların bütün növü təmsil etməyə biləcəyi sağqalma qərəzi yaratmışdır.

Transkriptomik analizdə Ep. gambianus məlumatı yoxdur. Bundan əlavə keyfiyyət və başlanğıc anticisim profili səbəbindən nəzarət nümunələri çıxarıldıqdan sonra diferensial ifadə analizləri tək bir PBS nəzarət fərdinə əsaslanmışdır. Tədqiqatçılar bu ikili müqayisələri açıq şəkildə ilkin nəticə kimi qiymətləndirirlər.

Qan transkriptlərinin təxminən %75-i hemoglobinə uyğun gəldiyinə görə aşağı səviyyədə ifadə olunan bəzi genlərin aşkarlanmamış olması mümkündür.

Yarasaların təbii infeksiya tarixçələri məlum deyil. Aktiv henipavirus infeksiyasını etibarlı şəkildə istisna etmək mümkün olmamışdır; buna görə bəzi anticisim dəyişikliklərinin qəfəs daxilindəki təbii məruz qalmalarla əlaqəli ola bilməsi tam istisna edilə bilməz. PBS qrupundakı bir yarasada eksperimentin sonunda görülən anti-Nipah-G artımı buna nümunə kimi müzakirə edilmişdir.

Ebola virusuna yoluxduğu dəqiq bilinən yarasalardan alınmış müsbət nəzarət serumunun olmaması xüsusilə Ebola seroloji testlərinin həssaslıq və spesifikliyinin dəqiq kalibrlənməsini məhdudlaşdırır.

Nipah qrupunda ikinci MVA dozasının hədəf Nipah antigenini daşımaması iki vaksin rejiminin 4. həftədən sonra ekvivalent olmamasına səbəb olmuşdur. Buna görə gen ifadəsi müqayisəsinin gücləndirici dozadan sonraya keçirilməməsi doğru, lakin əhatəni daraldan metodoloji qərardır.

Nəticələrin elmi mənası

Tədqiqatın ortaya qoyduğu əsas mənzərə yarasalardakı antiviral immunitetin yalnız “anticisim var/yox” şəklində şərh edilə bilməməsidir. Ei. helvum Nipah antigeninə güclü serum anticisimi və neytrallaşdırma cavabı göstərə bildiyi halda Ebola GP antigeninə qarşı aydın serum anticisimi yaratmamış, buna baxmayaraq yüzlərlə gen və müxtəlif immun yollarda molekulyar dəyişiklik göstərmişdir. Ep. gambianus isə araşdırıla bilən az sayda fərddə Ebola GP-yə aydın bağlanma cavabı yaratmış, lakin bu serum neytrallaşdırma testinə əks olunmamışdır.

Bu fərqlər vəhşi yarasalarda seroloji sürveyans nəticələri şərh edilərkən növün, hədəf viral antigenin və istifadə olunan testin birlikdə qiymətləndirilməli olduğunu göstərir. Eyni MFI dəyərinin müxtəlif növlərdə eyni bioloji məna daşıdığı fərz edilə bilməz; antigenə bağlanma, neytrallaşdırma və hüceyrəvi/transkriptomik cavab bir-birindən ayrı ölçmə səviyyələridir.

Mənbə və Metod Qeydi

Orijinal tədqiqat: Serological and transcriptomic response of African fruit bats to immune challenge with recombinant vaccines expressing Ebola or Nipah virus antigens.

Müəlliflər: Elinor Jax; Romain Garnier; Georgia Tsagkogeorga; Hubert Buczkowski; Louise Gibson; Pius Benia; Richard Suu-Ire; Vera M. Warmuth; Sylvester Languon; Osbourne Quaye; Lianying Yan; Christopher C. Broder; Stephen J. Rossiter; Edward Wright; Sarah C. Gilbert; Teresa Lambe; James L. N. Wood; Andrew A. Cunningham; Olivier Restif.

Məsul müəllif: Olivier Restif. Mənbədə bərabər birinci müəlliflik və ya bərabər töhfə işarəsi göstərilmir.

Qurumlar: University of Cambridge Department of Veterinary Medicine; Queen Mary University of London School of Biological and Behavioural Sciences; University of Sussex Viral Pseudotype Unit; Zoological Society of London Institute of Zoology; University of Ghana School of Veterinary Medicine; University of Ghana Department of Biochemistry, Cell and Molecular Biology və West African Centre for Cell Biology of Infectious Pathogens; Ludwig-Maximilians-Universität München Biozentrum Martinsried; Uniformed Services University Department of Microbiology and Immunology; Henry M. Jackson Foundation for the Advancement of Military Medicine; University of Oxford Pandemic Sciences Institute; Chinese Academy of Medical Sciences Oxford Institute; Oxford Vaccine Group.

Jurnal: Royal Society Open Science. Nəşriyyat: The Royal Society. Cild: 13. Sayı: 10. Məqalə nömrəsi: 252189. Nəşr tarixi: 7 Oktyabr 2026. DOI: 10.1098/rsos.252189. Qəbul tarixi: 11 Noyabr 2025. Qəbul edilmiş tarix: 8 İyun 2026.

Mənbə növü və resenziya: Resenziyalı tədqiqat məqaləsidir. Lisenziya: Creative Commons Attribution 4.0, CC BY 4.0.

Tədqiqat növü: Təbiətdən tutulmuş yetkin erkək Afrika meyvə yarasalarında rekombinant viral vektorlarla aparılan eksperimental in vivo immun stimullaşdırılması; serum anticisim analizi; lentiviral psevdotip neytrallaşdırma testi; bir növdə tam qan RNA-seq transkriptomik analizi və tamamlayıcı in vitro hüceyrə nəzarət eksperimentləri.

Mühüm metodoloji sərhəd: Eksperimentdə canlı Ebola və ya Nipah virusu ilə infeksiya aparılmamışdır. Vaksin vektorları Ebola GP və ya Nipah G antigenlərini ifadə edir. Buna görə nəticələr viral infeksiya patogenezi, yoluxduruculuq və ya təbii rezervuar qabiliyyəti ilə eyniləşdirilməməlidir.

Etik icazələr: Zoological Society of London, layihə WLE719, 26 May 2017; Ghana Council for Scientific Industrial Research, RPN 001/CSIR-IRB/2017, 22 June 2017.

Məlumat əlçatanlığı: Xam mRNA-seq məlumatları NCBI Sequence Read Archive-da PRJNA1054324 giriş nömrəsi ilə saxlanılmışdır. Tədqiqatda yaradılan qaralama Ei. helvum genomu və annotasiyası Figshare DOI 10.6084/m9.figshare.29117609.v2 altında; əsas serologiya və diferensial ifadə analizlərini təkrarlamaq üçün istifadə olunan S1–S3 məlumat dəstləri və R kodu Figshare DOI 10.6084/m9.figshare.29126510.v2 altında paylaşılmışdır. Əlavə material kolleksiyası DOI 10.6084/m9.figshare.c.8655631 kimi göstərilmişdir.

Maraqların toqquşması: Müəlliflər rəqabət aparan maraqların olmadığını bildirmişlər.

Maliyyələşdirmə: Tədqiqat Elinor Jax üçün Deutsche Forschungsgemeinschaft tədqiqat təqaüdü 438001934; Olivier Restif üçün Royal Society GCRF CH160115; James L. N. Wood, Andrew A. Cunningham və Osbourne Quaye üçün MRC MR/P025226/1; Romain Garnier üçün AXA Research Fund Junior Fellowship; ALBORADA Trust; Research England və Christopher C. Broder üçün NIH AI054715 dəstəyi ilə həyata keçirilmişdir.

Müəlliflərin AI bəyanatı: Mənbə məqalədə müəlliflər məqalənin hazırlanmasında süni intellekt dəstəkli texnologiyalardan istifadə etmədiklərini bildirmişlər.

Müəllif töhfələrinin xülasəsi: Elinor Jax formal analiz, metod, vizuallaşdırma və ilk qaralama; Romain Garnier konseptuallaşdırma və tədqiqat; Georgia Tsagkogeorga formal analiz və tədqiqat; Hubert Buczkowski metod və tədqiqat; Louise Gibson məlumat kurasiyası, metod və layihə idarəetməsi; Pius Benia tədqiqat; Richard Suu-Ire tədqiqat və layihə idarəetməsi; Vera M. Warmuth formal analiz; Sylvester Languon tədqiqat; Osbourne Quaye layihə idarəetməsi və nəzarət; Lianying Yan metod; Christopher C. Broder maliyyələşdirmə, metod və resurslar; Stephen J. Rossiter konseptuallaşdırma və nəzarət; Edward Wright tədqiqat və metod; Sarah C. Gilbert və Teresa Lambe metod və resurslar; James L. N. Wood və Andrew A. Cunningham konseptuallaşdırma, maliyyələşdirmə, layihə idarəetməsi və nəzarət; Olivier Restif konseptuallaşdırma, formal analiz, metod, layihə idarəetməsi, vizuallaşdırma və ilk qaralama vəzifələrini yerinə yetirmişdir. Məqalə bütün müəlliflərin yekun təsdiqi ilə nəşr edilmişdir.