Bu çalışma, soğuk preslenmiş kolza pres kekinden elde edilen ham protein ekstraktındaki napinin, dinamik yatak adsorpsiyonu kullanılarak seçici ve ölçeklenebilir biçimde ayrıştırılıp ayrıştırılamayacağını incelemiştir. Araştırmada katyon değiştirici bir adsorban önce laboratuvar tipi kesikli deneylerde, ardından 500 gram pres keki ve 10 litre ekstrakt kullanılan pilot sistemde sınanmıştır. Pilot ölçekte son napin fraksiyonunun toplam protein kütle oranı Dumas yöntemiyle %90,9 ± 1,2 olarak belirlenmiş, toplam napin geri kazanımı %82,1’e ulaşmış ve nihai tozdaki polifenol oranı %0,03 ± 0,01’e düşmüştür. Bununla birlikte çalışma hakem değerlendirmesinden geçmemiştir; pilot deneyler yalnızca iki tekrar içermekte, ürünün duyusal, teknolojik ve gerçek gıda formülasyonlarındaki performansı doğrudan sınanmamaktadır.

Dinamik yatak adsorpsiyonunun temel avantajı, klasik dolgulu kolon kromatografisindeki gibi bütünüyle berraklaştırılmış bir besleme gerektirmeden, parçacık içeren ham ekstraktlarla çalışabilmesidir. Ancak araştırmada ekstraktlar tamamen filtresiz kullanılmamıştır: laboratuvar ölçeğinde 20 µm naylon ağ, pilot ölçekte ise 40 µm metal filtreyle iri çözünmeyen maddeler uzaklaştırılmıştır. Bu nedenle çalışmadaki “ön berraklaştırma gerektirmeyen ham ekstrakt” ifadesi, geleneksel ince filtrasyon veya santrifüjleme yapılmamasını anlatmakta; hiçbir katı ayırma uygulanmadığı anlamına gelmemektedir.

Katyon değiştirici DBA-CEX adsorbanının %10 kırılma noktasındaki dinamik bağlama kapasitesi 147 ± 25 mg napin/mL adsorban olarak hesaplanmıştır. Laboratuvar deneylerinde napin bakımından yüksek içerikli fraksiyonlar elde edilmiş ve fitaz uygulamasının napin saflaştırma verimi veya son protein oranı üzerinde anlamlı etkisi görülmemiştir. Pilot ölçeğe geçildiğinde genel protein içeriği korunmuş olsa da RP-HPLC analizinde napin ve krusiferin piklerinin genişlemesine bağlı bir miktar analitik aşırı tahmin oluşmuştur. Bu nedenle pilot ürün için en güvenilir genel bileşim göstergesi olarak %90,9 ± 1,2’lik Dumas toplam protein sonucu öne çıkmaktadır.

Araştırmanın temel problemi nedir?

Kolza yağı üretiminden sonra geride kalan pres keki, önemli miktarda protein içeren bir yan akımdır. Bu proteinlerin başlıcaları napin ve krusiferindir. Ancak pres kekinin toplam protein içeriğini artırmak ile bu iki proteini birbirinden seçici biçimde ayırmak aynı işlem değildir. Geleneksel çöktürme yöntemleri toplam protein oranını artırabilse de napin ve krusiferin gibi farklı fraksiyonları yeterli seçicilikle ayırmayabilir.

Kolon kromatografisi daha yüksek seçicilik sunabilir; fakat klasik dolgulu yataklar parçacıklı, yağlı veya yeterince berraklaştırılmamış ekstraktlarla çalışırken tıkanma ve kirlenme riski taşır. Ayrıca birden fazla kromatografi adımı, tampon tüketimini, sermaye maliyetini, işlem süresini ve her aşamadaki ürün kaybını artırabilir. Araştırmanın temel sorusu, kromatografik seçiciliği korurken kaba kolza ekstraktını daha az ön işlemle kabul edebilecek ve laboratuvardan pilot ölçeğe aktarılabilecek bir sistem geliştirilip geliştirilemeyeceğidir.

Napin ve krusiferin arasındaki fark nedir?

Napin, yaklaşık 12–16 kDa molekül ağırlığında, 2S albumin sınıfında küçük bir depo proteinidir. Çalışmada yaklaşık 4 ve 9 kDa’lık polipeptit zincirlerinden oluştuğu ve izoelektrik noktasının yaklaşık pH 10–11 olduğu belirtilmektedir. Yüksek izoelektrik noktası nedeniyle napin, çalışma koşulu olan pH 6’da net pozitif yük taşımaktadır.

Krusiferin ise 12S/11S globulin sınıfındadır. Yaklaşık 50–60 kDa’lık altı alt birimin birleşmesiyle oluşan yaklaşık 300 kDa’lık hekzamerik bir yapı olarak tanımlanmıştır. İzoelektrik noktası yaklaşık pH 7,2’dir. Napin ile krusiferinin molekül büyüklüğü, çözünürlüğü ve yük davranışındaki farklılıklar, seçici ayırma işleminin temelini oluşturmaktadır.

Çalışma, seçiciliğin yalnızca tek bir yük farkıyla açıklanabileceğini göstermemektedir. Özellikle pH 6’da krusiferinin de kendi izoelektrik noktasının altında bulunması nedeniyle ayırma; proteinlerin yük yoğunluğu, sterik erişilebilirliği, çözünürlük davranışı ve adsorbanla etkileşimlerinin bileşik sonucudur. Araştırmacılar mekanizmanın tüm moleküler ayrıntılarını ayrı deneylerle çözümlememiştir.

Geleneksel yöntemlerde hangi sorunlar bulunmaktadır?

Alkali ekstraksiyon ve izoelektrik çöktürme, tohum proteinlerinin ayrıştırılmasında yaygın ve görece ucuz bir yaklaşımdır. Proteinler alkali ortamda çözündürülür, ardından asidik pH’a getirilerek çöktürülür. Ancak bu işlem çoğunlukla globulin bakımından zengin karışık bir fraksiyon üretmekte ve napin gibi albuminlerin seçici geri kazanımını sınırlamaktadır.

Araştırmada ele alınan önceki yöntemlerin bazıları %82–%95 aralığında protein içeriğine ulaşmış olsa da düşük geri kazanım, pH 12,5 gibi sert koşullar, organik çözücü kullanımı veya çok sayıda işlem basamağı gerektirmiştir. Sert alkali koşullar protein hidrolizi ve denatürasyonu riskini artırabilir; ayrıca polifenollerin proteinlerle bağlanmasını ve nişasta, yağ veya fenolik bileşiklerin birlikte çökelmesini kolaylaştırabilir.

Klasik dolgulu yatak kromatografisi ise yüksek seçicilik sağlayabilmesine karşın beslemenin parçacıklardan ve yağlardan arındırılmasını gerektirebilir. Kolonun tıkanması, yüksek tampon tüketimi ve çok aşamalı proses kayıpları, gıda bileşeni üretimindeki büyük ölçekli kullanımı zorlaştırmaktadır.

Dinamik yatak adsorpsiyonu nasıl çalışmaktadır?

Dinamik yatak adsorpsiyonu, adsorban parçacıklarının işlem sırasında hem süspanse hem de filtre yüzeyinde paketlenmiş durumda kullanılmasına olanak veren bir adsorpsiyon düzenidir. Çalışmanın Şekil 1’inde sistemin iki çalışma modu gösterilmektedir.

• Süspanse yatak modu: Permeat pompası kapalıyken adsorban parçacıkları karıştırma tankı ile filtre devresi arasında dolaşır. Parçacıkların sıvı içinde hareket etmesi, proteinlerin adsorban yüzeylerine erişimini kolaylaştırır.
• Paketlenmiş yatak modu: Permeat pompası çalıştırıldığında adsorban parçacıkları filtre yüzeyine doğru taşınır ve burada geçici, sıkı bir yatak oluşturur. Sıvı filtreden geçerken adsorban sistem içinde tutulur.

Bu geçiş, adsorbanın yükleme sırasında sıvıyla etkin biçimde temas etmesini, ardından yıkama ve elüsyon sırasında sistemden ayrılmadan tutulmasını sağlar. Klasik bir kolonda adsorban sabit yatak hâlindeyken, DBA sisteminde adsorbanın süspanse edilmesi kütle aktarımını desteklemekte ve partikül kaynaklı tıkanma riskini azaltmaktadır.

Ham protein ekstraktı nasıl hazırlanmıştır?

Soğuk preslenmiş kolza pres keki, 1:20 kütle/hacim oranında demineralize su içinde süspanse edilmiş ve 10 dakika karıştırılmıştır. Başka bir ifadeyle her bir birim pres keki için 20 birim su kullanılmıştır.

Fitaz uygulanan gruplarda enzimin son aktivitesi 12 U/mL ekstrakt olacak şekilde ayarlanmış ve karışım 40 °C’de 60 dakika inkübe edilmiştir. Kontrol grubunda fitaz kullanılmamıştır.

Her iki grupta da pH, sodyum hidroksitle 9,0’a yükseltilmiş ve alkali ekstraksiyon 30 dakika sürdürülmüştür. Ardından hidroklorik asitle pH 6,0’a düşürülmüş ve çözünmeyen iri parçacıklar 20 µm naylon ağla uzaklaştırılmıştır. Ortaya çıkan sıvı, çalışmada “ham ekstrakt” olarak tanımlanmıştır.

Protein içeriği nasıl hesaplanmıştır?

Numunelerin kuru maddesindeki azot oranı, 5,35 azot-protein dönüşüm katsayısıyla çarpılmıştır:

\[ Pr\% = Nitrogen\%_{DM} \times 5{,}35 \]

Burada Nitrogen%_DM, kuru madde esasındaki azot yüzdesini; Pr% ise hesaplanan protein kütle oranını göstermektedir. Katsayı, ölçülen azot miktarını tahmini protein miktarına dönüştürmektedir. Çalışmada yaygın genel katsayı olan 6,25 yerine kolza proteinlerine uygun kabul edilen 5,35 değeri kullanılmıştır.

Protein ekstraksiyon verimi çalışmada şu oranla tanımlanmıştır:

\[ yield_{protein} = \frac{Pr\%_{filtrate,\ pH\ 9}}{Pr\%_{press\ cake}} \times 100 \]

Pay, pH 9 filtratındaki protein oranını; payda ise başlangıç pres kekindeki protein oranını ifade etmektedir. Yazarlar bu değeri protein ekstraksiyon verimi olarak adlandırmıştır. Ancak formülde başlangıç ve filtratın toplam kuru madde kütleleri açıkça yer almadığı için bu oran, bütün başlangıç protein kütlesini izleyen ayrıntılı bir kütle dengesiyle aynı değildir.

Laboratuvar ölçekli kesikli adsorpsiyon nasıl uygulanmıştır?

Napini tutmak için LPS Biosolutions A/S tarafından sağlanan katyon değiştirici DBA-CEX adsorbanı kullanılmıştır. Adsorban, vakum filtresi üzerinde beş yatak hacmi 50 mM NaCl çözeltisiyle dengelenmiş, ardından filtre üzerinde kurutularak tartılmıştır.

Adsorban pH 6’daki ekstrakta 1 gram adsorban/100 mL ekstrakt oranında eklenmiştir. pH yeniden 6,0’a ayarlanmış ve karışım 30 dakika karıştırılmıştır. Napin adsorban üzerinde tutulurken bağlanmayan proteinler, özellikle krusiferin bakımından zengin akım, 20 µm ağdan geçirilerek toplanmıştır.

Adsorban beş yatak hacmi suyla yıkanmış, ardından bağlı napin 0,5 M NaCl kullanılarak elüe edilmiştir. Tuzlu napin çözeltisi 6–8 kDa kesim sınırına sahip diyaliz torbasına aktarılmış ve fazla suya karşı gece boyunca diyaliz edilmiştir. Tuzun uzaklaştırıldığı, iletkenliğin 1 mS/cm’nin altına düşmesiyle kontrol edilmiştir.

Laboratuvar ölçeğinde ne kadar seçicilik sağlanmıştır?

RP-HPLC analizine göre kontrol ekstraktının elüatındaki napin kuru madde oranı %100 ± 18, fitaz uygulanmış ekstraktın elüatında ise %97 ± 7 olarak hesaplanmıştır. %100’ün üzerine uzanan belirsizlik aralığı, değerin gerçek fiziksel bileşimden çok analitik ölçüm ve oran hesaplamasındaki belirsizliği yansıttığını göstermektedir; bir numunenin gerçek napin oranı fiziksel olarak %100’ü aşamaz.

Dumas azot analizinde toplam protein kuru madde oranı kontrol elüatında %94 ± 2, fitazlı elüatta %95 ± 12 bulunmuştur. RP-HPLC analizinde laboratuvar elüatlarında krusiferin saptanmamış, SDS-PAGE görüntülerinde ise yalnızca iz düzeyinde olabilecek bantlar görülmüştür.

Şekil 2A’da napinin ham madde ve bağlanmayan fraksiyonda düşük, elüatta ise belirgin biçimde yüksek olduğu görülmektedir. Şekil 2B’de krusiferin ham ve bağlanmayan akımda bulunurken elüatta ölçülemeyecek düzeye yaklaşmaktadır. Şekil 2C toplam protein oranının elüatta yoğunlaştığını göstermektedir.

Şekil 2D’deki SDS-PAGE jelinde napin bantları yaklaşık 10–15 kDa bölgesinde, krusiferine ait bantlar ise daha yüksek molekül ağırlıklarında görülmektedir. Fitaz uygulanmayan filtratta 110–260 kDa arasında zayıf yüksek molekül ağırlıklı bantlar bulunurken bunlar fitaz uygulanan örnekte daha az belirgindir. Yazarlar bu bantları olası protein kümeleri veya krusiferin oligomerleriyle ilişkilendirmiştir; ancak bu kimlik ayrıca doğrulanmamıştır.

Fitaz uygulaması saflaştırmayı iyileştirmiş midir?

Fitaz uygulaması napin geri kazanımı veya nihai ürünün protein oranı üzerinde anlamlı bir iyileşme oluşturmamıştır. Laboratuvar deneyinde anlamlı fark yalnızca posa fraksiyonunun protein oranında görülmüş ve bu fark için p ≤ 0,01 bildirilmiştir.

Fitaz, fitik asidi parçalayarak çözünebilir fosfat miktarını artırmaktadır. Araştırmacılara göre bu işlem posa fraksiyonundaki toplam kuru madde bileşimini değiştirerek kuru madde esasındaki protein yüzdesini yükseltmiş olabilir. Ancak fitazın napin bağlanmasını veya elüsyonunu belirgin biçimde değiştirdiği gösterilmemiştir.

SDS-PAGE görüntüsündeki sınırlı bant farklılıkları, fitazın bağlanmayan krusiferin bakımından zengin yan akımın agregasyon veya çözünürlük durumunu etkileyebileceğini düşündürmektedir. Bu olasılık çalışmada ayrı yapısal analizlerle doğrulanmamıştır.

Dinamik bağlama kapasitesi ne anlama gelmektedir?

Adsorbanın kapasitesi, %10 kırılma noktasındaki dinamik bağlama kapasitesiyle değerlendirilmiştir. Kırılma noktası, adsorbandan bağlanmadan çıkan napin konsantrasyonunun besleme konsantrasyonunun %10’una ulaştığı andır.

Hesaplama şu denklemle yapılmıştır:

\[ DBC_{10\%} = \frac{C_0 \times V_{10\%}}{V_C} \]

C₀, beslemedeki başlangıç protein konsantrasyonunu mg/mL cinsinden; V_10%, %10 kırılmaya kadar yüklenen besleme hacmini mL cinsinden; V_C ise adsorban hacmini mL cinsinden göstermektedir. Sonuç, bir mL adsorbanın kırılma başlamadan önce bağlayabildiği napin kütlesini verir.

Kapasite deneyinde 100 gram DBA-CEX adsorbanı, 800 mL sistem hacmi içinde toplam 24 litre ham ekstraktla aşırı yüklenmiştir. Bekleme süresi her sistem hacmi için 6 dakika tutulmuş ve her bir litre permeatta numune alınmıştır.

Şekil 3A’daki RP-HPLC kromatogramlarında adsorbana verilen toplam yük arttıkça bağlanmayan akımdaki napin pikinin büyüdüğü görülmektedir. Bu davranış adsorbanın giderek doygunluğa ulaştığını göstermektedir. Şekil 3B’de napin için C/C₀ oranının %10 çizgisini geçtiği yük kullanılarak kapasite hesaplanmıştır.

DBA-CEX adsorbanının dinamik bağlama kapasitesi 147 ± 25 mg napin/mL adsorban olarak bildirilmiştir. Bu değer iki tekrarın ortalamasıdır; şekillerdeki ayrı kırılma eğrilerinin çoğu tek bir temsili tekrara dayanmaktadır. Dolayısıyla kapasitenin değişkenliği daha büyük deney serileriyle değerlendirilmemiştir.

Pilot ölçekli sistem nasıl kurulmuştur?

Pilot deneylerde 500 gram kolza pres keki, toplam 10 litre ekstraksiyon hacminde işlenmiştir. Sistem; 40 µm gözenekli metal filtre, çapraz akışı yöneten pompa, ham ekstrakt besleme pompası ve permeat akışını yöneten pompa olmak üzere üç peristaltik pompa içermektedir.

Sistem hacmi 800 mL olarak belirlenmiş ve 100 gram, yaklaşık 150 mL DBA-CEX adsorbanı kullanılmıştır. Sistem hacmi üç pompanın eş zamanlı çalışmasıyla sabit tutulmuştur. Her sistem hacmi için bekleme süresi 6 dakika, besleme/boşaltma debisi 135 mL/dakika olarak ayarlanmıştır.

Napin yakalandıktan sonra debi 200 mL/dakikaya çıkarılmış ve adsorban 3,75 sistem hacmi demineralize suyla yıkanmıştır. Napin, 3,75 sistem hacmi 0,5 M NaCl ile adsorbandan ayrılmıştır. Bağlanmayan krusiferin bakımından zengin akım da membran işlemleriyle ayrıca yoğunlaştırılmıştır.

Membranla tuz giderme ve kurutma nasıl yapılmıştır?

Napin fraksiyonu için 10 kDa, krusiferin bakımından zengin fraksiyon için 100 kDa kesim değerine sahip spiral sarımlı membranlar kullanılmıştır. Her membranın alanı 0,33 m²’dir. Transmembran basıncı 0,7–1,0 bar arasında değişmiştir.

Retentat önce beş ila altı kat yoğunlaştırılmış, ardından hacim sabit tutularak su eklenen diafiltrasyon uygulanmıştır. İletkenlik 1 mS/cm’nin altına düşünceye kadar tuz giderme sürdürülmüştür. Yoğunlaştırılmış fraksiyonlar paslanmaz çelik tepsilerde dondurulmuş ve son olarak dondurarak kurutulmuştur.

Proteinler hangi analiz yöntemleriyle ölçülmüştür?

SDS-PAGE

Her numuneden 20 µL alınmış, su ve 4× LDS tamponuyla seyreltilmiş ve indirgenmeyen koşullarda 70 °C’de 10 dakika inkübe edilmiştir. Numuneler %4–12 Bis-Tris jele yüklenmiş, 200 V altında 55 dakika yürütülmüş ve Coomassie G-250 ile boyanmıştır. Bu yöntem napin ve krusiferinin molekül ağırlığına göre bant profillerini karşılaştırmak için kullanılmıştır.

Ters fazlı HPLC

Napin ve krusiferin miktarları ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisiyle ölçülmüştür. Numuneler 8 M ürede üç kat seyreltilmiş, 0,22 µm filtreden geçirilmiş ve C8 kolonda ayrılmıştır. Mobil fazlar suda %0,1 trifloroasetik asit ile asetonitrilde %0,1 trifloroasetik asitten oluşmuştur. Akış 0,3 mL/dakika, kolon sıcaklığı 30 °C, algılama dalga boyu 214 nm ve toplam analiz süresi 12 dakikadır.

Dumas azot analizi

Toplam protein, numunenin kuru maddesi ve Dumas yöntemiyle ölçülen azot içeriği kullanılarak hesaplanmıştır. Numunelerin kuru maddesi 75 °C’de kütle sabitlenene kadar ölçülmüş ve azot miktarı 5,35 katsayısıyla proteine dönüştürülmüştür.

Polifenol analizi

Polifenoller %80 aseton ve %0,1 asetik asitle ekstrakte edilmiş, 20.000 g’de 10 dakika santrifüjlenmiş ve azot akışı altında çözücü uzaklaştırılmıştır. Yeniden çözülen numuneler UHPLC ile 330 nm’de analiz edilmiş ve sonuçlar sinapik asit eşdeğeri olarak hesaplanmıştır.

Toplam çözünür protein oranı nasıl belirlenmiştir?

Sıvı numunedeki toplam çözünür protein konsantrasyonu şu ilişkiyle hesaplanmıştır:

\[ C_{protein} = \frac{m_{protein}}{m_{DM}} \times \frac{m_{DM}}{m_{sample}} \]

m_protein/m_DM, kuru maddenin ne kadarının protein olduğunu; m_DM/m_sample ise toplam numunenin ne kadarının kuru madde olduğunu gösterir. İki oran çarpıldığında toplam sıvı numunedeki protein kütle oranı elde edilmektedir.

Pilot ölçekte hangi protein oranlarına ulaşılmıştır?

Pilot elüatındaki napin kütle oranı RP-HPLC ile %96,4 ± 6,8 olarak hesaplanmıştır. Aynı analiz krusiferin oranını %21,8 ± 4,2 olarak vermiştir. İki oranın toplamının %100’ü aşması, RP-HPLC piklerinin genişlemesi ve karmaşık numune matrisinin bileşen miktarlarını fazla tahmin etmesiyle açıklanmıştır.

Dumas yöntemiyle ölçülen toplam protein oranı %90,9 ± 1,2’dir. Bu değer, numunenin toplam protein içeriğini ayrı ayrı kromatografik piklerin toplamından bağımsız olarak göstermektedir ve pilot ürün için daha tutarlı genel bileşim ölçüsüdür.

Pilot ölçekli grafiklerde ham maddede ve bağlanmayan fraksiyonda napin oranı düşük, elüatta ise çok yüksek görünmektedir. Krusiferin ağırlıklı olarak bağlanmayan ve 100 kDa membranla tutulan fraksiyonda yoğunlaşmıştır. SDS-PAGE görüntüsü de napinin elüatta, krusiferinin ise 100 kDa retentatta yoğunlaştığını desteklemektedir.

Laboratuvar elüatında kromatografik olarak krusiferin saptanmamasına karşılık pilot elüatında ölçülebilir krusiferin bildirilmiştir. Bu fark, ölçek büyütmede seçiciliğin bütünüyle değişmeden kalmadığını ve pilot matrisinin analitik olarak daha karmaşık olduğunu göstermektedir.

Krusiferin bakımından zengin yan akımda ne bulunmuştur?

Bağlanmayan akımın membranla işlenmesi sonucunda elde edilen fraksiyonda napin oranı %10,1 ± 0,2, krusiferin oranı %76,1 ± 0,2 ve toplam protein oranı %73 ± 4 olarak ölçülmüştür.

Bu sonuç, DBA prosesinin yalnızca napin ürünü oluşturmakla kalmayıp krusiferin bakımından zengin ikinci bir protein akımı da üretebileceğini göstermektedir. Bununla birlikte çalışma, bu yan akımın fonksiyonel özelliklerini veya nihai kullanımını ayrıntılı olarak değerlendirmemiştir.

Napin kütle dengesi ne göstermektedir?

Pilot kütle dengesi, pH 6’daki başlangıç ekstraktında bulunan 16,7 gram ekstrakte edilebilir napini temel almıştır. Ana DBA adımındaki dağılım şu şekilde raporlanmıştır:

Bağlanmayan akımın ek membran işlemiyle 0,8 gram daha napin kazanılmış ve çalışma nihai toplam geri kazanımı 13,7 gram, yani %82,1 olarak bildirmiştir. Metnin başka bir cümlesinde demineralizasyon öncesi geri kazanım %88 olarak verilmiştir. Bu iki değer prosesin farklı aşamalarını temsil etmektedir; çalışma aralarındaki farkı ayrıntılı bir ara kütle dengesiyle açıklamamıştır.

Elüsyondan sonra adsorban üzerinde yaklaşık 3,9 gram napin kaldığı hesaplanmıştır. Araştırmacılar bunu 0,5 M NaCl elüsyonunun görece hafif kalmasına bağlamış ve daha yüksek tuz konsantrasyonunun veya daha alkali koşulların elüsyonu geliştirebileceğini belirtmiştir. Bu öneri mevcut çalışma içinde deneysel olarak sınanmamıştır.

Kütle dengesi tablosunda ayrıca açıklanmamış bir aritmetik tutarsızlık bulunmaktadır. “Residual fraction” satırında 0,3 gram napin, başlangıç miktarının %0,1’i olarak yazılmıştır. Ancak 16,7 gramlık temel üzerinden 0,3 gram yaklaşık %1,8’e karşılık gelmektedir. Tablo, 0,8 ve 0,3 gramın toplamını da 0,9 gram olarak vermektedir. Bu değerler muhtemel bir yazım, yuvarlama veya tablo hazırlama hatasına işaret etmektedir; çalışma hatanın kaynağını açıklamamıştır.

Polifenol miktarı ne kadar azalmıştır?

Kolza pres kekinin polifenol oranı kuru madde esasına göre %1,22 olarak ölçülmüştür. Bu değer yalnızca tek bir tekrara dayanmaktadır. Laboratuvar ham ekstraktlarında oran %0,73 ± 0,02, laboratuvar elüatlarında %0,20 ± 0,16 ve pilot napin tozunda %0,03 ± 0,01 olarak belirlenmiştir.

Fitazlı ve fitazsız numunelerin polifenol sonuçları arasında anlamlı fark bulunmadığı için bu örnekler analizde birleştirilmiştir; p değeri 0,05’ten büyüktür.

Nihai tozun düşük ölçülen polifenol oranına rağmen kahverengi olduğu bildirilmiştir. Araştırmacılar kalan polifenollerin napine hidrofobik, elektrostatik veya kovalent biçimde bağlanmış olabileceğini tartışmaktadır. Prosesin düşük iletkenlikli bağlama ve yüksek iletkenlikli elüsyon koşulları nedeniyle hidrofobik veya elektrostatik olarak bağlı bileşiklerin büyük bölümünün uzaklaşmış olabileceği, kalan kısmın ise olası kovalent bağlardan kaynaklanabileceği ileri sürülmüştür. Bu mekanizma doğrudan kimyasal bağ analiziyle kanıtlanmamıştır.

Çalışmanın desteklediği sonuçlar

• DBA-CEX adsorbanı pH 6’daki kolza protein ekstraktından napini seçici olarak tutabilmiştir.
• Laboratuvar ve pilot ölçek ürünlerinde toplam protein oranı %90’ın üzerinde ölçülmüştür.
• Pilot ölçekte nihai napin geri kazanımı %82,1 olarak bildirilmiştir.
• Adsorbanın dinamik bağlama kapasitesi 147 ± 25 mg napin/mL adsorban düzeyindedir.
• Fitaz uygulaması napin saflaştırma verimini veya son protein oranını anlamlı biçimde değiştirmemiştir.
• Pilot napin tozundaki polifenol oranı %0,03 ± 0,01’e düşmüştür.
• Bağlanmayan akımdan krusiferin bakımından zengin ikinci bir protein fraksiyonu elde edilebilmiştir.
• Proses, geleneksel ince berraklaştırma adımlarına ihtiyaç duymadan kaba filtrelenmiş, parçacık içeren ekstraktla çalışmıştır.

Çalışmanın kanıtlamadığı sonuçlar

• Üretilen napin tozunun ticari ölçekte ekonomik olduğunu gösteren bir maliyet analizi yapılmamıştır.
• Kesintisiz ve uzun süreli endüstriyel işletme, adsorban ömrü veya çoklu yeniden kullanım çevrimleri değerlendirilmemiştir.
• Ürünün tadı, kokusu, rengi veya tüketici kabulü duyusal testlerle ölçülmemiştir.
• Düşük polifenol miktarının gıdalardaki fonksiyonelliği doğrudan iyileştirdiği deneysel olarak gösterilmemiştir.
• Napin ürününün gerçek bir içecek, emülsiyon, fırıncılık ürünü veya başka gıda formülasyonundaki performansı sınanmamıştır.
• Gıda sınıfı üretim, mevzuat uygunluğu veya endüstriyel hijyen doğrulaması yapılmamıştır.
• Pilot ölçekte yalnızca iki tekrar kullanıldığı için proses değişkenliğinin geniş kapsamlı istatistiksel değerlendirmesi yapılmamıştır.
• Kalan kahverengi bileşiklerin kovalent bağlı polifenoller olduğu doğrudan kanıtlanmamıştır.

Gıda ve yan ürün değerlendirme açısından ne ifade etmektedir?

Çalışma, yağ üretiminin ardından kalan kolza pres kekinin yalnızca düşük değerli bir artık olarak değil, birbirinden ayrılabilen protein fraksiyonlarının hammaddesi olarak değerlendirilebileceğini göstermektedir. Napin ve krusiferinin ayrı akımlarda yoğunlaştırılması, tek bir toplam protein konsantresine göre daha kontrollü ürün geliştirme olanağı sağlayabilir.

DBA yaklaşımının en önemli proses katkısı, adsorbanın süspanse ve paketlenmiş durumlar arasında geçebilmesidir. Bu özellik, katı parçacıklara karşı klasik sabit kolonlardan daha toleranslı bir çalışma düzeni oluşturabilir. Böylece santrifüj, mikrofiltrasyon veya çok aşamalı berraklaştırma ihtiyacının azaltılması hedeflenmektedir.

Bununla birlikte “ölçeklenebilir” nitelemesi laboratuvar ölçeğinden 10 litrelik pilot ekstraksiyona başarılı geçişi ifade etmektedir. Bu sonuç tonlarca hammaddenin işlendiği endüstriyel üretim, sürekli vardiya çalışması veya ekonomik rekabet gücü kanıtı değildir.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

Hammadde ve ekstraksiyon koşulları

Laboratuvar adsorpsiyon koşulları

Pilot DBA koşulları

Analitik yöntemler

Ana bulgular

İstatistiksel ve deneysel sınırlılıklar

• Pilot ölçekli saflaştırma n = 2 tekrar ile gerçekleştirilmiştir.
• Dinamik kapasite değeri iki tekrarın ortalamasıdır; kromatogram ve kırılma grafikleri tek temsili tekrarı göstermektedir.
• Kolza pres kekinin başlangıç polifenol değeri yalnızca tek numuneye dayanmaktadır.
• Fitaz karşılaştırmasında anlamlı fark yalnızca posa protein oranı için p ≤ 0,01 düzeyinde bildirilmiştir.
• Polifenol analizinde fitazlı ve fitazsız gruplar arasında p > 0,05 olduğundan numuneler birleştirilmiştir.
• Pilot RP-HPLC sonuçları pik genişlemesi ve örnek karmaşıklığı nedeniyle aşırı tahmin içermektedir.
• Elüsyon sonrasında adsorban üzerinde önemli miktarda napin kalmıştır.
• Kütle dengesi tablosunda 0,3 gramlık artık fraksiyonun yüzdesi ve ara toplamıyla ilgili açıklanmamış aritmetik uyumsuzluk bulunmaktadır.
• Uzun süreli sürekli çalışma, adsorban yeniden kullanımı ve proses ekonomisi değerlendirilmemiştir.

Kaynak ve Yöntem Notu

Çalışmanın tam özgün adı:Scalable Purification of Napin From Rapeseed Press Cake Using Dynamic Bed Adsorption

Yazarlar ve sıralamaları: Peter Fog Lihme, Kasper Engholm-Keller, Marianne N. Lund ve Poul Erik Jensen.

Eş katkı bilgisi: Metinde eş birinci yazarlık veya eş katkı beyanı bulunmamaktadır.

Sorumlu yazar: Peter Fog Lihme. Sorumlu yazarın e-posta adresi incelenen sürümde belirtilmemiştir.

Kurum: Department of Food Science, Faculty of Science, University of Copenhagen, Rolighedsvej 26, 1958 Frederiksberg C, Danimarka.

DOI: 10.2139/ssrn.6966121.

Dergi: Çalışmanın hakemli bir dergide yayımlandığı veya kabul edildiği doğrulanmamıştır.

Yayın platformu: SSRN.

Özgün yayınevi: Hakemli bir yayınevi bulunmamaktadır. SSRN, Elsevier’e ait preprint ve erken araştırma platformudur; hakemli yayınevi olarak sunulmamıştır.

Yayın yılı: 2026.

Kaynak türü: Laboratuvar ölçekli kesikli adsorpsiyon, pilot ölçekli dinamik yatak adsorpsiyonu, membran işleme ve protein bileşim analizlerini birleştiren preprint araştırma çalışması.

Hakemlik durumu: Bu çalışma hakem değerlendirmesinden geçmemiş bir preprinttir; sonuçları bu sınırlılık dikkate alınarak okunmalıdır.

Resmî bağlantı:SSRN çalışma kaydı

Çıkar çatışması: Peter Fog Lihme, çalışmada kullanılan dinamik yatak adsorpsiyonu teknolojisinin ortak mucididir ve ilgili US20250381530A1 patent başvurusunda mucit olarak listelenmiştir. Diğer yazarlar çıkar çatışması bildirmemiştir. Bu ilişki, sistemin teknik sonuçlarının yorumlanmasında dikkate alınması gereken önemli bir şeffaflık bilgisidir.

Finansman: Araştırma Novo Nordisk Foundation tarafından NNF21OC0065495 numaralı destek kapsamında finanse edilmiştir.

Yapay zekâ kullanım beyanı: Yazarlar ChatGPT’nin yalnızca dilbilgisi, dil iyileştirme ve cümle yapılandırması için kullanıldığını; bilimsel içerik, veri analizi, yorum ve sonuçların araştırmacılar tarafından geliştirildiğini ve yapay zekâ destekli metnin yazarlarca denetlenip düzenlendiğini beyan etmiştir.

Bu Türkçe makale, yüklenen çalışmanın metni, formülleri, süreç şeması, kromatogramları, SDS-PAGE görselleri, protein bileşim grafikleri, kütle dengesi ve polifenol tablosu incelenerek hazırlanmıştır. Kaynak kimliğinin doğrulanması dışında çalışmaya dışarıdan bilimsel bulgu eklenmemiştir.

İncelenen preprint sürümünde şekil numaralandırma ve belge üretimiyle ilgili editoryal sorunlar bulunmaktadır. Pilot ölçekli şekil önceki dinamik kapasite şekliyle aynı “Figure 3” numarasını taşımakta, son sayfada ise şekil başlığında “Error! No text of specified style in document” ifadesi görünmektedir. Bu sorunlar verilerin içeriğini doğrudan değiştirmese de sürümün henüz nihai yayın düzenlemesinden geçmediğini göstermektedir.

Çalışmanın temel sınırlılıkları; düşük pilot tekrar sayısı, RP-HPLC sonuçlarındaki pik çakışması, kütle dengesi tablosundaki aritmetik tutarsızlık, duyusal ve gıda formülasyonu testlerinin bulunmaması, adsorbanın uzun dönem yeniden kullanımının sınanmaması ve endüstriyel ekonomik değerlendirme yapılmamasıdır. Çalışma, ticari üretim başarısı veya onaylanmış gıda sınıfı ürün kanıtı sunmamaktadır.